国家教育部博士点基金(20060698050)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- 肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选
- 2012年
- 目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA(siRNA)序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR(real time-PCR)和免疫印记杂交法(Western blot)分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降(P<0.05),质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。
- 马亚东王子明种铁
- 关键词：肾透明细胞癌缺氧诱导因子-1Α质粒小干扰RNA
