吉林省科技厅国际合作项目(20130413035GH)
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
- 相关作者：李瑶冯宪敏鞠晓红王月华张宏梅更多>>
- 相关机构：吉林医药学院首都医科大学吉林市中心医院更多>>
- 发文基金：吉林省科技厅国际合作项目国家自然科学基金吉林省教育厅科研项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 以减毒沙门氏菌为载体的抗贾第虫肠溶疫苗制备及免疫效果检测
- 2015年
- 目的以携带α1-giardin DNA的减毒沙门菌为对象,探讨肠溶制剂的制备、免疫剂量和免疫效果。方法携带有贾第虫α1-giardin基因的重组减毒沙门菌经培养扩增冻干后,对各种辅料,包括微分硅胶、分散剂、润滑剂、崩解剂、包衣液等成分与减毒沙门菌的相容性,及包衣条件进行检测。采用最佳配方制备肠溶片剂,用于动物免疫试验。初始免疫后第25d后,分别检测血清和小肠灌洗液中抗rα1-giardin特异性IgG和SIgA的水平;并用106个贾第虫滋养体灌胃,每天检测各组小鼠粪便中的滋养体和(或)包囊的排出率。结果肠溶片剂的处方中微分硅胶和分散剂的用量分别为菌粉用量的10%和2倍;润滑剂和崩解剂的用量分别占处方量的0.8%和2%;包衣液的浓度为20%,包衣增重为处方量的6%。每个包衣片活菌含量在4×106以上。动物试验表明,以SL7207/pVAX1-rα1-giardin肠溶片剂免疫鼠小肠灌洗液中特异性抗rα1-giardin SIgA的水平明显高于对照组,并在攻虫试验具有46.7%的减虫率,明显高于rα1-giardin肌注免疫组(23%)(P<0.01)。结论本研究为多种以减毒沙门菌为载体的DNA疫苗的肠溶制剂的研究提供了实验依据,如规模化生产,该处方尚需进一步完善。
- 崔佰吉李瑶张宏梅姜晓明冯宪敏
- 关键词：减毒沙门菌蓝氏贾第鞭毛虫
- 棘阿米巴原虫全长cDNA文库的构建被引量：4
- 2014年
- 目的快速构建棘阿米巴滋养体全长cDNA文库，为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定基础。方法以棘阿米巴滋养体分离株，ed,RNA为模板，以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物逆转录合成单链cDNA，采用长距PCR（10ng—DistancePCR，LDPCR）方法扩增得到双链cDNA，经蛋白酶K消化和sfiI酶切后通过色谱柱CHROMASPON-400按分子质量进行分离，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收纯化0．4～2．5kb分离产物。取1μlPCR产物与λ噬菌体连接，以XL1-BLUE为受体菌扩增得到cDNA文库，分别用梯度法和随机测序法检测文库滴度与重组率。结果成功构建棘阿米巴cDNA文库，文库滴度为3．85×10^7pfu／ml，插入片段大小在0．4～2．5kb之间．重组率为100％（20／20）。结论棘阿米巴滋养cDNA文库构建成功，为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定了基础。
- 王月华冯宪敏李瑶鞠晓红孙艳美
- 关键词：棘阿米巴CDNA文库
- 蓝氏贾第鞭毛虫表面变异抗原反义mRNA的鉴定
- 2014年
- 目的鉴定编码蓝氏贾第鞭毛虫（简称贾第虫）表面变异抗原（VSP）的正义和反义mRNA。方法采用Trizol法抽提贾第虫单克隆滋养体总RNA,SMART法逆转录合成cDNA。设计合成针对VSPs基因3′端保守区域的特异性引物（内、外引物各1条）,结合SMART引物采用巢式PCR分别扩增得到来源于正义和反义mRNA的cDNA片段。将PCR产物与pGEM-T载体连接并测序,测序结果与GenBank库中的已知序列进行比对。根据测序结果设计特异性引物,以巢式PCR产物为模板,进行正义和反义cDNA的检测。结果巢式PCR显示,VSP正义mRNA和反义mRNA的cDNA均被成功扩增,电泳鉴定扩到产物分别位于0.1~4kb和0.2~2kb。经克隆、测序和序列比对,共获得34个贾第虫VSP编码序列,其中5个来源于正义mRNA的扩增产物,29个来源于反义mRNA的扩增产物,所得VSP编码基因均含有贾第虫VSP mRNA N端变异区和C端特异性保守区。根据5个正义mRNA序列设计的特异性引物在正义mRNA均得到扩增产物,而在反义mRNA仅有4个得到扩增产物。从29个反义mRNA序列中挑选3个设计特异性引物进行PCR,正义mRNA和反义mRNA均得到扩增产物。结论贾第虫VSP基因转录的多个正义mRNA和反义mRNA序列同时存在,该基因存在转录后基因沉默调节机制。
- 郑文彧冯宪敏鞠晓红李瑶王月华
- 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫
- 蓝氏贾第鞭毛虫PPDK多肽抗体制备与定位研究被引量：2
- 2015年
- 目的制备蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)磷酸烯醇式丙酮酸双激酶(PPDK)特异性多肽抗体并进行PPDK定位。方法采用DNAstar软件和BIOSUN生物医学软件,结合抗原表位分析的基本原理,对贾第虫PPDK的氨基酸序列进行抗原分析,最终确定贾第虫PPDK的优势抗原表位肽。将上述抗原表位肽与KLH进行偶联,获得3个偶联蛋白,经脱盐柱吸附、洗脱纯化后,对抗原表位肽-KLH偶联蛋白进行定量测定。将得到的3条多肽-KLH偶联物混合,用PBS稀释为1mg/ml,分别与第1、15、29和43d免疫4只新西兰白兔[于颈背部皮下多点(至少8点)注射多肽抗原2mg],获得抗PPDK抗血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot试验检测抗体的滴度和特异性。以R3为一抗,以DyLight 649抗兔IgG为二抗,采用免疫荧光法进行PPDK的细胞定位。结果根据PPDK抗原分析结果,最终确定PPDK的优势抗原表位3个,即p1:TPENQPANSELC(氨基酸位点12-23),p2:KTRYGRKTDPELC(氨基酸位点167-178)和p3:DLQKKLAEDMNKKHC(氨基酸位点641-654)。与KLH偶联获得3个多肽偶联蛋白,即P1、P2和P3。3个偶联蛋白联合免疫新西兰白兔获得4份抗PPDK抗血清,纯化后的抗体分别命名为R1、R2、R3和R4。Western blot检测显示,R3和R4可与PPDK特异性结合,无交叉反应。以R3为一抗进行免疫荧光试验,结果显示PPDK主要定位于贾第虫细胞的胞浆内。结论本研究获得2个可与贾第虫PPDK特异性结合的抗体,并初步判断PPDK主要分布于贾第虫细胞胞浆,为PPDK功能研究奠定了基础。
- 冯宪敏张宏梅李瑶鞠晓红卢思奇
- 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫多肽抗体
