国家公益性行业科研专项(200903027)
- 作品数：14 被引量：81H指数：7
- 相关作者：孟闯焦新安陈祥徐正中吴清民更多>>
- 相关机构：扬州大学中国农业大学安阳工学院更多>>
- 发文基金：国家公益性行业科研专项国家重点基础研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学电气工程生物学更多>>
- 重组牛白细胞介素4的原核表达及其单克隆抗体研制被引量：7
- 2011年
- 目的:原核表达重组牛白细胞介素4(rBoIL-4)并制备针对抗rBoIL-4的单克隆抗体(mAb)。方法:通过PCR从重组质粒pSP73-BoIL-4中扩增BoIFN-γ基因,分别克隆入表达载体pGEX-6p-1和pET-30a(+)中,构建重组菌并对其进行诱导表达、纯化和鉴定。以纯化的融合蛋白rHis-BoIL-4为免疫原,用纯化的rGST-BoIL-4为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIL-4的mAb。结果:获得表达BoIL-4基因的重组菌BL21(pGEX-6p-1-BoIL-4)和BL21(DE3)(pET-BoIL-4),重组蛋白相对分子质量(Mr)的大小分别为39 000和19 000,且以包涵体的形式存在。获得7株可稳定分泌抗rBoIL-4 mAb的细胞株,命名为2B8、4A10、5D6、5D8、7G10、8B7和10F8,这些mAb腹水的效价依次为5 000、160 000、10 000、640 000、5 000、40 000和40 000,mAb亚类均为IgG1。Dot-ELISA的结果表明,7株mAb只与融合蛋白rHis-BoIL-4和rGST-BoIL-4起反应,而不与其他重组细胞因子和对照细菌起反应,显示出良好的特异性。Western blot试验显示,7株mAb均能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性条带。同时7株mAb均能与BoIL-4的标准品起反应。结论:7株抗rBoIL-4的mAb均具有高度的特异性,为进一步研究其在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定了基础。
- 陈祥张成全徐正中孟闯黄金林潘志明焦新安
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- γ-干扰素试验和皮试变态反应对检测奶牛结核病的比较被引量：29
- 2011年
- 目的评价γ-干扰素试验、单纯颈部皮试变态反应和比较皮试变态反应检测在牛结核病检疫过程中的效果。方法在牛结核病检疫过程中,953头奶牛同时进行γ-干扰素试验和单纯颈部皮试变态反应检测,其中的190头奶牛进行了比较变态反应试验。结果在同步进行γ-干扰素试验和单纯颈部皮试变态反应检测的953头奶牛中,两者的阳性符合数为147头,阳性符合率为63.8%(294/461),两者的阴性符合数为639头,阴性符合率为88.4%(1 278/1 445);在进行比较皮试变态反应的190头奶牛中,γ-干扰素试验与比较皮试变态反应的阳性符合数为3头,阳性符合率为75%(6/8),阴性符合数为185头,阴性符合率为99.5%(370/372);单纯颈部皮试变态反应与比较皮试变态反应的阳性符合数为4头,阳性符合率为72.7%(8/11),阴性符合数为183头,阴性符合率为99.2%(366/369)。结论单纯颈部皮试变态反应有较高的检出率;同单纯颈部皮试变态反应相比,比较皮试变态反应有较好的特异性;γ-干扰素试验在保持较高灵敏度的同时,具有较好的特异性。
- 陈祥徐正中时振华范峰蒋锁俊孟闯黄根成单锋丽焦新安
- 关键词：牛结核
- 小鼠巨噬细胞系体外感染卡介苗的应答被引量：1
- 2010年
- 【目的】探讨小鼠巨噬细胞系RAW264.7体外感染卡介苗的应答。【方法】体外感染RAW264.7细胞23h后,分析细胞形态和细胞表面共刺激分子的表达。然后去除培养上清中的卡介苗,继续培养不同时间,通过CFSE、annexin V/PI和Rh123标记,分析宿主细胞的应答。【结果】卡介苗感染23h后,细胞生长状态良好,细胞内能明显观察到吞噬泡中的BCG。细胞表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86、CD11b的表达明显升高,CD11c、I-Ad以及H-2Kd的表达变化不明显。CFSE标记卡介苗后,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐减弱,但是4天后仍然明显地高于对照组。除去培养上清中的卡介苗后继续培养,含有卡介苗的细胞逐渐减少,继续培养60h后基本检测不到。另外,卡介苗感染不能诱导细胞凋亡,线粒体膜电位先升高后降低,5d后,基本上与对照组一致。【结论】通过以上分析,为卡介苗免疫机理的研究提供了重要数据。
- 胡茂志陈义芳韩璐季琰郑佳玉孟闯周海霞陈祥焦新安刘秀梵
- 关键词：卡介苗RAW264.7共刺激分子线粒体膜电位
- 结核分枝杆菌CFP32蛋白的原核表达及其细胞免疫学检测价值评价被引量：2
- 2014年
- 目的克隆、表达与纯化结核分枝杆菌CFP32蛋白,并对其进行细胞免疫学特性评价。方法 PCR扩增cfp32基因片段,与pET-30a(+)构建重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,对融合蛋白进行纯化,ELISPOT试验测定其细胞免疫应答,通过牛结核外周血IFN-γ释放试验,评价其作为刺激原的能力。结果构建了正确基因序列的重组质粒,并在BL21(DE3)中高效可溶性表达,融合蛋白大小为32ku,纯度达91.8%。ELISPOT显示CFP32蛋白刺激机体分泌IFN-γ和IL-4的细胞数相当,呈现Th1/Th2的平衡。在牛结核外周血IFN-γ释放试验中,其阳性符合率和阴性符合率分别为40%和73.3%,与牛型PPD刺激结果的相关系数为0.684。结论成功构建CFP32蛋白重组表达菌,该蛋白引起的免疫应答趋向于Th1/Th2的平衡,并且有作为刺激原用于牛结核病检测的潜力。
- 万婷孟闯陈祥万李文志发徐正中单法殷月兰焦新安
- 关键词：结核分枝杆菌细胞免疫
- 结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白的融合表达及其细胞免疫学特性被引量：2
- 2014年
- 本研究旨在原核表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白,分析其在小鼠模型中的细胞免疫应答特性,并评价其作为牛结核外周血IFN-γ释放试验特异性刺激原的能力。首先,通过构建pET30a(+)-esat6-linker-lhp重组质粒,BL21(DE3)中诱导表达ESAT6-CFP10融合蛋白并纯化,随后经细胞表面分子的FACS分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的细胞免疫应答特性,同时作为刺激原用于奶牛IFN-γ释放试验,评价其用于牛结核病诊断的潜能。结果表明:SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blotting证实其对ESAT6、CFP10单克隆抗体有良好免疫反应性。FACS结果显示其上调树突状细胞表面CD80和CD86分子以及小鼠脾CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IFN-γ分泌细胞数显著高于IL-4分泌细胞数,显示其诱导产生Th1型免疫应答的能力。在479份奶牛外周血样本的γ-干扰素释放试验中,ESAT6-CFP10蛋白与PPD作为刺激原的阳性符合率为70.0%,阴性符合率为95.2%。本研究成功表达ESAT6-CFP10融合蛋白,其具备诱导Th1型免疫应答特性,在牛结核外周血γ-干扰素释放试验中可作为候选刺激抗原。
- 孟闯万婷徐正中单法解晓莉申峻松范峰陈祥焦新安
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT6CFP10细胞免疫牛结核病
- 牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用被引量：16
- 2010年
- 以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素(Pokeweed mitogen,PWM)刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清(13.8μg/mL)配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL(30.5 pg/100μL)的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。
- 陈祥牛中伟徐正中孟闯孙林黄金林潘志明焦新安
- 关键词：Γ-干扰素单克隆抗体
- 结核分枝杆菌TB10.4抗原的分子生物学特性研究进展被引量：1
- 2011年
- 结核病（tuberculosis,TB）这种古老的慢性人兽共患病,4千多年前就已流行于全球,而且至今仍危胁着全球近1/3人口的健康[1]。自1921年诞生且是当前唯一可行的卡介苗（Bacillus Calmette-Gufirin，BCG），是至今接种人数最多、使用范围最广的疫苗之一，但该疫苗的免疫保护效果并不理想，
- 欧珍陈祥孟闯焦新安
- 关键词：分子生物学特性结核分枝杆菌抗原免疫保护效果人兽共患病卡介苗
- 重组牛γ-干扰素单克隆抗体的研制被引量：13
- 2009年
- 为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb。结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γmAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8和9G11。腹水的效价除单抗9G11外,其余效价都在1∶80 000以上;除5G4mAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1。Dot-ELISA结果表明,所得单抗只与融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ反应,而不与其它重组细胞因子和对照细菌反应,显示其良好的特异性。Western blot显示所获单抗能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性条带。同时所获单抗均能与牛IFN-γ标准品反应。13株单抗均为针对rBoIFN-γ的特异性mAb,为进一步研究rBoIFN-γmAb在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定基础。
- 张成全陈祥牛中伟杨卫冲徐正中孟闯潘志明黄金林焦新安
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- 结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-TB7.7的融合表达及其在小鼠上的细胞免疫学特性(英文)
- 2014年
- 目的构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-TB7.7融合蛋白的表达质粒,利用大肠杆菌表达系统获得原核蛋白,在小鼠模型上评价其细胞免疫学特性。方法通过PCR扩增出lhp-linker-esat6-linker和linker-Rv2654c片段,构建正确的pET32a(+)-lhp-linker-esat6-linker-Rv2654c原核表达质粒,转化BL21(DE3)后在IPTG诱导下表达,并纯化该融合蛋白,western blot验证蛋白的免疫原性,通过T细胞增殖实验和夹心ELISA评价其细胞免疫学特性。结果成功构建pET32a(+)-lhp-linker-esat6-linker-Rv2654c原核表达质粒,SDS-PAGE显示在45kDa处出现目的条带,Western blot证明融合蛋白对anti-ESAT6,anti-CFP10,anti-His单抗和rGST-TB7.7多抗血清均有反应,说明该融合蛋白具有良好的免疫反应性,T淋巴细胞增殖实验显示该蛋白能明显引起小鼠的T细胞免疫反应。夹心ELISA实验也表明,融合蛋白刺激产生的IFN-γ和IL-4水平与对照组相比均有显著性差异,同时融合蛋白诱导产生的IFN-γ水平明显高于IL-4。结论 CFP10-ESAT6-TB7.7融合蛋白在大肠杆菌系统中实现可溶性表达,并获得免疫反应性良好的纯化产物,该融合蛋白能引起明显的T细胞增殖,具有诱导Th1型免疫应答的特性。
- 万婷孟闯徐正中单法解晓莉殷月兰陈祥焦新安
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达细胞免疫
- 区域风电生产运营监控系统的开发被引量：7
- 2013年
- 风能资源丰富的地区一般都建有多个风电场。这些风电场厂址分散,并且采用不同型号的风电机组,其监控与数据采集(SCADA)系统也不相同,给风电公司的生产运营管理带来很大困难,也给电网的调度和安全运行带来很多问题。为此,开发了区域风电生产运营监控系统。该系统在WEB上实现SCADA功能,可对不同数据规约进行统一整合,进而可对不同机型的SCADA系数数据进行统一管理,使区域风电公司能够远程集中监测和控制管理区域内分散的风电场,为风电生产的"无人值守"打下基础。
- 包大恩
- 关键词：集中监控
