中国科学院知识创新工程重要方向项目(KZCX2-YW-G-065)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：鞠建华张海波李苏梅张长生张光涛更多>>
- 相关机构：中国科学院中国海洋大学中国科学院研究生院更多>>
- 发文基金：中国科学院知识创新工程重要方向项目中国科学院“百人计划”国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定
- 2012年
- 【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。
- 胡涛张光涛朱义广李苏梅张海波张改云杨晓红鞠建华张长生
- 关键词：生物合成
- 浅蓝霉素产生菌海洋异壁放线菌WH1-2216-6遗传操作体系的建立被引量：3
- 2011年
- 【目的】建立二联吡啶类抗生素浅蓝霉素的产生菌海洋异壁放线菌Actinoalloteichus sp.WH1-2216-6的遗传操作体系,以便对浅蓝霉素的相关生物合成基因进行体内敲除和基因回补等遗传操作。【方法】以整合型质粒pSET152为外源DNA,探索和优化了异壁放线菌WH1-2216-6菌株与大肠杆菌进行接合转移实验的方法和条件,以此为基础,利用PCR-targeting系统在体外构建了一个浅蓝霉素二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶基因敲除的cosmid质粒pCSG2104,并在优化后的条件下通过接合转移将其转入异壁放线菌WH1-2216-6野生型菌株。【结果】获得了异壁放线菌WH1-2216-6菌株的浅蓝霉素二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶基因缺失的双交换突变株,发酵结果显示该突变株失去了产生浅蓝霉素A和浅蓝霉素D的能力。【结论】高浓度的MgSO4对大肠杆菌与异壁放线菌的接合转移有促进作用,介导了异壁放线菌WH1-2216-6菌株的遗传操作体系的成功建立,为进一步研究浅蓝霉素的生物合成基因和对浅蓝霉素结构进行组合生物合成改造奠定了基础,同时也为其他类似放线菌的遗传操作体系的建立提供了借鉴和参考。
- 林钦恒张光涛李苏梅张海波鞠建华朱伟明张长生
- 关键词：生物合成
