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地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸综合征病毒被引量：8: 2007年; 本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF7基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出394 bp的cDNA。用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物,并以此为模板制备出地高辛标记的cDNA探针。特异性试验表明,该探针仅与PRRSV核酸反应,与PPV、PRV、FMDV、HCV及PCV2的核酸反应为阴性。敏感性检测表明,采用CSPD化学发光检测时,硝酸纤维素膜上最低检出量为62.5 pg;尼龙膜上最低检出量为0.5 pg。应用该探针,在尼龙膜上对10份PRRSV阳性病料的组织RNA样品进行检测,结果均为阳性,与RT-PCR检测结果一致,证明该方法可用于PRRSV临床样品检测。; 李广明姜平李玉峰秦承学; 关键词：地高辛标记探针斑点杂交化学发光

Ubiquitin基因介导下的PRRSV GP5基因免疫特性研究被引量：5: 2007年; 目的:探讨泛素基因对GP5基因免疫的影响。泛素-蛋白酶体途径是一种高效蛋白降解途径,主要负责真核细胞内蛋白选择性降解。方法:本研究将ORF5 DNA片段克隆到含泛素(Ub)基因的表达载体pCMV-Ub和pCMV载体,构建成重组质粒pCMV-Ub-GP5和pCMV-GP5。两种质粒DNA肌肉注射免疫BALb/c小鼠后,分别检测体液免疫反应和细胞免疫反应,比较GP5单基因和Ub-GP5融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果:二者均可诱生PRRSV ELJSA抗体和中和抗体,其抗体水平无明显差别,但Ub-GP5融合基因诱生的淋巴细胞反应和CTL反应明显高于GP5基因。结论:泛素基因可以促进GP5诱生细胞免疫反应。; 蒋文明汤玉瑜李玉峰姜平; 关键词：PRRSV GP5 UBIQUITIN 细胞免疫应答

Ubiquitin基因介导下的PRRSV GP5基因免疫特性研究: 2007年; 泛素—蛋白酶体途径是一种高效蛋白降解途径,主要负责真核细胞内蛋白选择性降解。GP5囊膜糖蛋白是PRRSV的主要结构蛋白。为了评价泛素基因对GP5基因免疫的影响,本研究将ORF5 DNA片段克隆到含泛素(Ub)基因的表达载体pCMV-Ub和pcMV载体,构建成重组质粒pCMV-Ub-GP5和pCMV-GP5。两种质粒DNA肌肉注射免疫BALb/c小鼠后,分别检测体液免疫反应和特异的细胞免疫反应,比较单基因和融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果表明二者均可诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对GP5的特异性细胞免疫反应明显增强。; 蒋文明汤玉瑜李玉峰姜平; 关键词：PRRSV GP5 UBIQUITIN 细胞免疫应答

重组GP5AB蛋白间接ELISA检测PRRSV抗体方法的研究被引量：7: 2007年; 利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。抗原最适包被浓度为2μg/mL,最佳封闭液为0.15%BSA,37℃封闭2 h后,再4℃封闭24 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60m in,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为90 m in,37℃显色10 m in,S/P≥0.284为阳性,S/P≤0.26为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果,变异系数均小于7%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品,并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较,结果显示3种抗原检测的结果基本一致。; 顾小雪姜平韩研妍李玉峰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA

PRRSV M蛋白细胞系的培育及其在细胞毒性T淋巴细胞检测方法中的应用: 2007年; 目的探讨PRRSV M基因在哺乳动物细胞NIH/3T3细胞中的表达,建立一种非放射性、简便易行的检测特异性细胞毒T淋巴细胞的方法。方法应用RT-PCR扩增得到M基因并克隆入真核表达载体pcDNA3,构建成重组表达载体pcD-NA3-M;将重组质粒转染至NIH/3T3细胞,G418筛选克隆;IFA检测M蛋白在转基因NIH/3T3细胞中的表达。用表达M蛋白的重组腺病毒rAd-M免疫小鼠,用表达M蛋白的NIH/3T3细胞和乳酸脱氢酶法检测PRRSV特异性细胞毒T淋巴细胞的杀伤效应。结果获得有G418抗性的NIH/3T3/M细胞克隆;IFA检测到有PRRSV M蛋白表达。重组腺病毒rAd-M免疫组可以诱发CTL应答,并明显高于wtAd和PBS对照组。结论培育成功一株能表达PRRSV M蛋白的细胞株NIH/3T3/M,可作为PRRSV CTL检测方法中的靶细胞,证明PRRSV M基因能够诱发特异性的细胞免疫。; 蒋文明姜平李玉峰; 关键词：PRRSV 真核表达 CTL

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国家教育部博士点基金(2003030712)