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登革病毒Ⅱ型对人脐静脉血管内皮细胞通透性的研究被引量：2: 2011年; 目的研究登革病毒Ⅱ型（DENV-2）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）通透性的影响。方法DENV一2病毒滴定，DENV-2接种HUVEC单层细胞，用间接免疫荧光法动态观察DENV-2感染HUVEC的情况（30min，1、3、6、12、24、30、36、42、48、72b），实时定量荧光PCR方法检测病毒载量，transwell法检测DENV-2对HUVEC通透性的影响，透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果DENV－2对HUVEC通透性的影响30min时作用最为明显，其次为42h时。且病毒载量与HUVEC通透性改变呈正相关。透射电镜结果显示有细胞微绒毛脱落，胞质溶解，部分核膜间隙增宽，甚至是细胞核中也存在裂隙，部分线粒体嵴消失甚至空化，线粒体髓样变，包膜不完整。结论DENV-2对HUVEC通透性有影响，为探究登革病毒的发病机制提供一定的理论依据。; 任玮左丽吕秉乐崔冬冰; 关键词：登革病毒人脐静脉血管内皮细胞通透性

登革2型病毒NGC株感染白纹伊蚊C6/36细胞中浓核病毒DNA的扩增和序列测定: 2008年; 目的:探索白纹伊蚊C6/36细胞对登革2型病毒(Dengue Type 2 virus,DEN2)不敏感的原因。方法:根据Genbank提供的DEN2新几内亚株(NGC株)NS1基因序列设计引物,设立病毒对照组、病毒DNA酶(DNase)处理组和细胞对照组,通过提取核酸、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、限制性内切酶(HindⅢ)酶切、1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR及其酶切产物,并对其扩增产物进行序列测定,用软件比对与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒(Densonucleosis virus,DNV)基因的同源性。结果:经RT-PCR,细胞和病毒组均出现约1300bp的条带,不能被HindⅢ酶切,而病毒DNase处理组未能扩增出此条带;经GenBank比对,该片段序列与白纹伊蚊C6/36细胞DNV部分序列的同源性达95%以上。结论:C6/36细胞对DEN2不敏感的原因是由于伊蚊C6/36DNV的污染。; 王娇左丽周永兵; 关键词：登革热病毒伊蚊属

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响被引量：1: 2014年; 目的:研究登革2型病毒(DENV-2)、登革2型病毒国际参考株(NGC)E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株(M)E基因1-476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通透性的影响。方法:将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用transwell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果:DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3 h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变。结论:DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响。; 任玮左丽吕秉乐; 关键词：登革热病毒 E基因细胞膜通透性

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建: 2009年; 目的:克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法:用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1(+)的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1(+)-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果:阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论:成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1(+)-NS1。; 任丽娟左丽朱海东; 关键词：登革热病毒克隆细胞

两株登革2型病毒E基因重组质粒免疫BALB／c小鼠产生特异性抗体水平的比较: 2009年; 目的用含登革2型病毒（Dengue type2virus，DEN2）B株和NGC株E基因部分序列pcDNA3．1重组质粒初次和加强免疫BALB／c小鼠，观察免疫小鼠体液免疫应答的差异。方法用两株含DEN2E基因部分序列（1～476bp）的pcDNA3．1重组质粒与含有佐剂的重组质粒共同免疫BALB／c小鼠，初次免疫后第14天、28天分别加强免疫1次，共免疫3次。收集初次免疫后第14、28、42、70和98天外周血标本，间接ELISA法测定小鼠血浆特异性IgM／IgG类抗体水平，细胞病变抑制法检测特异性抗体水平。结果不同DEN2毒株E基因部分序列的pcDNA3．1重组质粒初次和加强免疫BALB／c小鼠诱导特异性IgM、IgG类抗体的产生存在差异，B株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间。结论DEN2两毒株E基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异。; 王娇左丽王丛李学政; 关键词：登革2型病毒 E基因重组质粒 BALB/C小鼠特异性抗体

登革病毒感染树突状细胞的分子机制研究进展: 2010年; 李佳怡左丽孙汭; 关键词：登革病毒感染树突状细胞分子机制登革休克综合征亚热带地区伊蚊传播

临床分离2型登革病毒突变株E蛋白N端158氨基酸基序免疫原性初探: 2010年; 目的:Ⅱ型登革病毒临床分离突变株(B株)E基因区部分序列的原核表达载体构建,蛋白表达、复性和纯化,及其免疫原性的初探。方法:将B株E基因1～476bp序列克隆入原核表达载体pET28a(+),经酶切、测序鉴定正确后转入表达菌,IPTG诱导后将包涵体变性,复性,纯化后的蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot和ELISA进行抗体鉴定。结果:成功构建了pET28a(+)-B-E原核表达载体,在表达菌中以包涵体形式稳定高表达,分子量为20kD。利用蛋白的His标签进行Western blot鉴定确定该蛋白为重组B-E蛋白,得到的可溶蛋白纯度大于90%。B-E蛋白免疫BALB/c和C57BL/6小鼠均可以得到有效的多克隆抗体。结论:B-E蛋白对BALB/c和C57BL/6小鼠具有免疫原性,其中ELISA鉴定免疫C57BL/6小鼠抗体的滴度为1∶12800,Western blot鉴定免疫BALB/c小鼠抗体滴度为1∶500。; 李佳怡商正玲左丽; 关键词：登革病毒包膜蛋白蛋白表达纯化免疫原性

登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达被引量：1: 2008年; 目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476bp的原核表达载体并进行原核表达。方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50。结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1ml。结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用。; 刘世国左丽王娇; 关键词：登革热病毒基因基因表达

DEN-2分离株E基因部分序列原核蛋白表达: 2009年; 目的通过构建登革2型病毒(DEN-2)临床分离株(B株)E基因区1-476bp的原核表达载体,进行原核表达,为DEN-2E蛋白功能的研究提供基础依据。方法将DEN-2B株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-Eb;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的细胞半数致死量(TCID50)。结果成功构建了pET28a(+)-Eb原核表达重组质粒;SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,其相对分子量约为23kDa,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western blot表明,该目的蛋白可与DEN-2鼠单克隆抗体结合。用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%。DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-5.31。结论pET28a(+)-Eb可在BL21(DE3)菌株中高效表达;DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有明显的细胞毒作用。; 刘世国左丽王娇; 关键词：原核表达

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国家重点基础研究发展计划(2008CB517408)

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