国家高技术研究发展计划(2005AA21905)
- 作品数：6 被引量：27H指数：4
- 相关作者：窦忠英李军吕长荣窦琳赵婷更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学广东海洋大学宁夏大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划陕西省科学技术研究发展计划项目教育部科学技术研究重大项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达被引量：11
- 2007年
- 【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为63 kD;以IPTG终浓度为0.8 mmol.L-1,诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。
- 李军吕长荣窦琳窦忠英
- 关键词：NANOG基因原核表达GST融合蛋白小鼠
- 从包涵体中纯化重组小鼠Nanog转录因子
- 2009年
- 利用BL21/pET-32a-Nanog表达菌株诱导表达Nanog融合蛋白,经破碎、高速离心、洗涤,获得Nanog蛋白粗制品,用8 moL/L尿素变性溶解Nanog融合蛋白,离心取上清,进行Histrap HP亲和层析纯化,复性,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定得到了纯度为97%以上的重组小鼠Nanog蛋白。建立了一种可行的从包涵体中纯化重组小鼠Nanog蛋白的方法,为Nanog蛋白的活性检测及其基因表达调控机理的功能研究奠定基础。
- 李军李军李勇窦忠英
- 关键词：小鼠NANOG包涵体纯化
- 胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离、纯化和鉴定被引量：8
- 2007年
- 旨在优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系，为糖尿痛研究和治疗提供种子细胞。采用胶原酶消化法，分离培养出胰岛样细胞团（ICCs），对其进行贴壁培养，从中纯化出上皮样细胞。采用MTT法测定其生长情况并绘制生长曲线。采用免疫组织化学染色检测分离得到细胞的PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nesfin、Glut2、Vimenfin、Insulin表达情况。应用流式细胞仪检测其表面标志。由分离培养的ICCs成功纯化出上皮样细胞；传40代，每代冻存106～10s个细胞；生长曲线显示其传代第3天进入对数生长期，第5天进入平台期；免疫组织化学染色显示其表达PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin；不表达Insulin；流式细胞仪分析表明其表达CD29、CD44、CD166，不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。由胎儿胰腺能分离出具有自我更新能力的上皮样细胞，为导管来源，具干细胞特性。
- 乔海赵婷王赟杨春荣效梅窦忠英
- 关键词：胎儿胰腺胰腺干细胞胰岛样细胞团上皮样细胞
- 小鼠Nanog基因的克隆及对人宫颈癌上皮细胞的作用被引量：4
- 2007年
- 目的:克隆小鼠Nanog基因并构建带绿色荧光蛋白的真核表达载体pG-Nanog,观察其对人宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)中的表达,旨在为进一步观察其对成体细胞的表型变化及细胞增殖奠定前期实验学基础。方法:实验于2006-03/09在西北农林科技大学陕西省干细胞研究中心完成。Nanog基因的克隆参照庄淑珍的方法。Nanog基因真核表达载体的构建参照GeneBank中的小鼠Nanog基因序列,以pNA992为模板扩增Nanog基因,PCR产物以BglⅡ和SacⅡ双酶切,同时将pEGFP-C1用BglⅡ和SacⅡ鉴定,将该质粒命名为pG-Nanog。Hela细胞用含10%新生牛血清的Dulbecco’s改良培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,DMEM)培养,转染Hela细胞。转染前1d,在6孔板的每个孔中接种1.2×105个细胞,待细胞生长至60%～70%汇合时,取pG-Nanog与空载体各4μg分别加入500μL无血清无抗生素的DMEM培养液中,同时将6μL稀释于500μL无血清无抗生素的DMEM(干粉)培养液中,将两者混合,室温静置20min,将复合物加入到细胞中,置37℃,体积分数0.05的CO2培养箱中转染24h后吸出复合物加入完全培养基,48h后观察荧光。合成内源对照β-actin,收集转染4d后的细胞提取RNA,反转录为cDNA,然后分别扩增Nanog基因和β-actin基因。采用RT-PCR的方法检测Hela细胞中Nanog基因的表达。结果:①pEGFP-C1载体经双酶切后获得约1kbp的Nanog基因真核表达载体片段,同预期结果相一致,测序结果同GeneBank中的序列同源性达到99.7%。②将转染48h后的Hela细胞置于荧光显微镜下观察,可见明显的荧光,转染pG-Nanog的细胞绿色荧光蛋白集中于细胞核,将转染4d后Hela细胞的总RNA进行RT-PCR检测,产物经琼脂糖电泳分析,只有转染pG-Nanog的细胞中才能够检测到Nanog基因的相应条带。③转染48h后,对细胞进行抗增殖细胞核抗原免疫组化染色,未转染细胞和转染空质粒细胞及转染pG-Nanog细胞染色结果均呈阳性,转染了pG-Nanog的Hela
- 窦琳吕长荣李军贾文文赵婷窦忠英
- 关键词：基因真核细胞基因表达HELA细胞
- 丝裂霉素C处理后鼠胚成纤维细胞活力分析被引量：2
- 2007年
- 为了探讨丝裂酶素C处理后鼠胚成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）活力的变化规律，试验用10μg／mL丝裂酶素C处理MEF，研究丝裂酶素C处理时间及其处理后细胞接种量、血清浓度和细胞代次对MEF活力的影响。结果表明，用10μg／mL丝裂酶素C处理2和3h，MEF活力比处理4h的稳定，处理2h的MEF活力与处理3h的没有显著差异；用10μg／mL丝裂酶素C处理3h后，MEF以（0．8～1．6）×10^4／孔接种96孔板，其活力比2．0×10^4／孔和4．0×10^4／孔接种的稳定；用含体积分数10％犊牛血清培养液培养的MEF活力，比用含体积分数2％，5％，15％和20％犊牛血清培养液培养的稳定；第1，3代MEF活力比第5，7代的稳定。表明，用10μg／mL丝裂酶素C处理2～3h，第1，3代MEF以（0．8～1．6）×10^4／孔接种96孔板，用含体积分数10％犊牛血清培养液培养，是利用丝裂酶素C制备MEF饲养层的适宜条件。
- 余树民王晗窦忠英
- 关键词：MTT丝裂霉素C细胞活力
- 无血清分离昆明系小鼠胚胎干细胞被引量：4
- 2008年
- 以昆明系小鼠胚胎为研究材料,以丝裂霉素C处理的胎鼠成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）为饲养层,在胚胎干细胞（Embryonic stemcells,ESCs）培养液中添加血清替代物（Knockout serumreplacement,KSR）以替代胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）,并与添加FBS的培养液进行对比,研究了昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM（Inner cell mass,ICM）集落形成以及ESCs分离的情况。结果表明,在添加KSR的培养液中,胚胎在培养3~5 d贴壁,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的培养液;5~7 d形成ICM集落,集落未分化形态可维持2~3 d,培养10 d ICM集落仍可保持典型的未分化形态;ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率与添加FBS的培养液相比差异不显著（P〉0.05）,但2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的培养液,其中有2株ESCs在添加KSR的培养液中传到7代;所分离细胞显示碱性磷酸酶染色强阳性,Oct-4、Nanog的免疫组化染色阳性,具有ESCs的特点。结论：在ESCs培养液中添加KSR比添加FBS更有利于维持ICM集落及ESCs的未分化状态。
- 余树民严兴荣陈冬梅王晗窦忠英
- 关键词：胚胎
