广州市科技计划项目(2003J1-C0221)
- 作品数：8 被引量：32H指数：4
- 相关作者：文剑明张萌张文敏肖刚谢丹更多>>
- 相关机构：福建医科大学中山大学中山大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：广州市科技计划项目福建省自然科学基金广东省医学科学技术研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 肿瘤-睾丸抗原LAGE-1基因的原核表达纯化和抗血清制备被引量：1
- 2006年
- 目的:构建人肿瘤-睾丸抗原LAGE-1的原核表达质粒,表达、纯化LAGE-1融合蛋白并制备GST-LAGE-1多克隆抗体。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人肝癌组织LAGE-1基因3′端片段,连入原核表达载体pGEX-4T-1(+),构建原核表达质粒pGEX-LAGE-1并测序。将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,经包涵体透析复性和谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统分离纯化目的蛋白。用纯化的融合蛋白GST-LAGE-1免疫新西兰大白兔,间接ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并采用Western blot检测GST-LAGE-1多克隆抗体特异性。结果:RT-PCR扩增得到LAGE-1基因3′端264bp片段,测序结果与GenBank公布序列一致;成功构建pGEX-LAGE-1原核表达质粒,含有该质粒的大肠埃希菌经IPTG诱导后表达相对分子质量约为36×103的蛋白,经包涵体复性和GST融合蛋白纯化系统纯化,得到重组蛋白GST-LAGE-1,纯度达90%;制备兔抗GST-LAGE-1抗体,纯化的抗体经Western blot证实可与目的蛋白特异性结合。结论:获得了纯化的肿瘤-睾丸抗原LAGE-1重组蛋白及其特异性多克隆抗体,为进一步研究LAGE-1抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。
- 张文敏张萌姜桔红黄爱民文剑明
- 关键词：抗原基因逆转录聚合酶链反应
- 黑色素瘤抗原-A3致敏的树突状细胞对人肝癌细胞的体外杀伤作用
- 2007年
- 【目的】观察经黑色素瘤抗原-A3(melanoma antigen gene,MAGE-A3)致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化的淋巴细胞对人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的体外杀伤作用。【方法】采用粒—巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4,IL-4)从人外周血中诱导树突状细胞,经MAGE-A3抗原致敏后与T淋巴细胞共培养,以淋巴细胞为效应细胞,分别以表达MAGE-A3抗原的肝癌细胞株H4M、不表达MAGE-A3抗原的正常肝细胞为靶细胞,收集T淋巴细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。【结果】负载MAGE-A3抗原的DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞有明显的杀伤作用,其对肝癌细胞的杀伤率显著性高于正常肝细胞对照组(P<0.05)。【结论】MAGE-A3蛋白抗原致敏的树突状细胞疫苗可激活特异性的CTL,在体外诱导出较强的对人肝癌细胞株的细胞毒作用。
- 肖刚石灵春谭敏张维彬杨海峰文剑明
- 关键词：癌症疫苗
- MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备被引量：3
- 2005年
- 【目的】构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体。【方法】利用RT- PCR方法扩增MAGE-3基因片段.连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEX- MAGE-3并测序。将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化。用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性。【结果】构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达-相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3。制备了兔抗GST-MAGE-3抗体。Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合。【结论】获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具。
- 肖刚张文敏张萌谢丹郭爱林文剑明
- 关键词：原核表达重组蛋白纯化抗体
- MAGE-A3在肝癌组织中的表达及意义被引量：5
- 2008年
- 目的检测黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)在肝癌组织中的表达,为应用MAGE-A3抗原对肝癌患者进行特异性抗肿瘤免疫治疗及判断预后提供理论依据。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测31例肝癌组织及相应癌旁组织中MAGE-A3基因的表达,应用组织芯片技术、免疫组织化学方法分析178例肝癌组织及相应癌旁组织中MAGE-A3抗原的表达。结果31例肝癌组织标本中有23例(74.19%)表达MAGE-A3基因,而相应的癌旁组织MAGE-A3基因均不表达。178例肝癌组织中102例表达MAGE-A3抗原(57.30%),相应的癌旁组织MAGE-A3抗原均不表达。MAGE-A3蛋白表达与肿瘤转移有关(P<0.05),而与HBsAg、AFP水平和分化程度均无关(P>0.05)。结论MAGE-A3基因在肝癌组织中有较高表达,这使得以该基因编码蛋白作为肿瘤疫苗用于肝癌的免疫治疗成为可能。表达MAGE-A3的肝癌患者预后较差。
- 肖刚谭敏胡少为石灵春文剑明
- 关键词：肝细胞癌逆转录-聚合酶链反应组织芯片
- NY-ESO-1和热休克蛋白70融合基因的构建和原核表达被引量：1
- 2006年
- 目的构建热休克蛋白(HSP)70和肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1融合基因,并在大肠杆菌中诱导表达。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株HepG2扩增HSP70基因,测序后插入pGEX-ESO1质粒中,构建NY-ESO-1与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-ESO1-HSP70,IPTG诱导含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白,Western blot鉴定蛋白的特异性。结果扩增得到长度为1 917 bp的人HSP70全长基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致;获得pGEX-ESO1-HSP70融合基因原核表达质粒,经IPTG诱导,在BL21(DE3)中表达分子量约106 kD的融合蛋白(包括GST 26 kD,NY-ESO1 10 kD,HSP7070 kD),Western blot检测该蛋白可与HSP70特异性结合。结论成功构建pGEX-ESO1-HSP70重组表达质粒,并获得高效表达的ESO1-HSP70融合蛋白,为HSP70-多肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。
- 张文敏姜桔红张萌文剑明
- 关键词：热休克蛋白70NY-ESO-1融合基因原核表达
- 人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用被引量：6
- 2005年
- 目的:克隆人NY-ESO-1基因,进行原核表达和分离纯化,并初步应用于肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测。方法:通过RT-PCR技术从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1基因片段,插入原核表达载体pGEX4T-1(+)中,构建重组表达质粒pGEX/ESO1,导入大肠杆菌BL21(DE3),诱导目的蛋白表达,经包涵体透析复性和GSTrap亲和层析纯化目的蛋白,Westernblot鉴定。应用间接ELISA方法初步检测50例肝癌患者血清和20例正常人血清NY-ESO-1抗体的表达。结果:扩增得到NY-ESO-1基因3'端276bp片段,与GeneBank公布序列一致,构建的pGEX/ESO1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约36kD的GST-ESO1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%。50例肝细胞癌患者血清中4例检测到NY-ESO-1抗体(8%),正常人血清均为阴性。结论:成功构建pGEX/ESO1重组表达质粒,得到有活性的NY-ESO-1融合蛋白,对肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测有一定的应用价值。
- 张文敏肖刚张萌谢丹郭爱林文剑明
- 关键词：NY-ESO-1原核表达纯化ELISA
- 肝细胞癌NY-ESO-1基因/蛋白表达与临床病理特征及肿瘤转移的关系被引量：5
- 2005年
- 背景与目的:NY-ESO-1属癌症-睾丸抗原家族,能激发肿瘤患者同时产生细胞免疫和体液免疫,特异杀伤肿瘤细胞,被认为是目前免疫原性最强的肿瘤抗原。本研究旨在探讨NY-ESO-1在肝细胞癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析62例肝癌和相应癌旁肝组织NY-ESO-1m RNA表达;将145例肝癌石蜡组织制成芯片(132例有效),应用免疫组织化学EliVisionTM两步法观察NY-ESO-1蛋白的表达和分布。结果:NY-ESO-1基因在肝细胞癌中的阳性率是27.4%(17/62),肝癌伴门脉癌栓者达40%(10/25),高于不伴门脉癌栓的18.9%(7/37);NY-ESO-1蛋白主要分布在肝癌细胞胞浆,在肝癌组织芯片中的阳性率为18.9%(25/132),肝癌伴转移病变者为29.6%(16/54),不伴转移病变的阳性率仅11.5%(9/78),二者比较有显著性差异(P<0.05);NY-ESO-1基因和蛋白在H BsAg阳性肝癌标本中阳性率分别为28.3%(15/53)和19.1%(22/115),AFP≥20滋g/L标本的阳性率为29.5%(13/44)和20.7%(19/93),与H BsAg阴性和AFP正常的肝癌比较均无显著性差异(P>0.05);所有癌旁肝组织均未见NY-ESO-1的表达。结论:NY-ESO-特异表达于肝癌细胞,在有转移病变的病例中有较高的阳性率,提示NY-ESO-1可能与肝癌病情进展和转移有关,可作为肝癌。
- 张文敏肖刚谢丹张萌郭爱林文剑明
- 关键词：组织芯片临床病理特征
- NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株的特异性杀伤作用被引量：12
- 2009年
- 目的:探讨肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1(New York-esophageal-1)致敏树突状细胞体外诱导特异性CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。方法:重组质粒pGEX-ESO1经原核诱导表达并纯化GST-ESO1融合蛋白肽。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养人外周血来源的树突状细胞(dendritic cells,DCs),经GST-ESO1融合蛋白肽致敏后诱导特异性CTL增殖。以此CTL为效应细胞,分别以NY-ESO-1阳性表达的肝癌细胞株HepG2和不表达NY-ESO-1的肝癌细胞株H2P为靶细胞,MTT法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。结果:重组质粒pGEX-ESO1经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达相对分子质量约36 000的GST-ESO1融合蛋白肽,纯化后的质量浓度为50μg/ml;经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导成功培养人外周血DCs,其表型分子HLA-DR为91.4%、CD86为70.5%、CD83为71.2%、CD80为55.3%。NY-ESO-1致敏的DCs能明显诱导CTL增殖,此CTL对肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著高于GST刺激组、未致敏DC组和无DC刺激组(均P<0.05),效靶比为50∶1时杀伤效应达到最高峰[(53.23±3.78)%,P<0.01];相同条件下CTL对H2P细胞无特异性杀伤作用。结论:NY-ESO-1抗原致敏的DCs在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对NY-ESO-1阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗提供了一条新思路。
- 张文敏陈裕庆张萌凌航文剑明
- 关键词：NY-ESO-1树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞
- NY-ESO-1和热休克蛋白70融合基因的构建和原核表达
- 目的构建热休克蛋白（HSP）70 和睾丸肿瘤抗原NY-ESO-1融合基因,在大肠杆菌中诱导表达。方法应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞株HepG2扩增HSP70基因,测序后插入 pGEX-ESO1质粒中,构建NY-ESO...
- 姜桔红张文敏张萌文剑明
- 关键词：热休克蛋白70NY-ESO-1融合基因原核表达
- 文献传递
