北京市科委基金(Z07010501780701)
- 作品数：8 被引量：31H指数：4
- 相关作者：李刚史利军张坤李伟马丽娟更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所吉林大学河北北方学院更多>>
- 发文基金：北京市科委基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立被引量：3
- 2011年
- 根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μmol·L-1,内引物浓度0.8μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 mmol·L-1,dNTP浓度0.8 mmol·L-1,甜菜碱浓度0.5 mmol·L-1,BstDNA聚合酶浓度8 U,最佳反应温度65℃;扩增出的EDSV基因呈特征性梯状条带,显色反应呈绿色荧光;检测EDSV的灵敏度高,是普通PCR检测的10倍,可检测到60个拷贝的基因组DNA;特异性强,与鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡胚致死孤儿病毒(CELO)无交叉反应;该方法重复性好,稳定性高,可准确快速地进行减蛋综合征病毒的检测.
- 董春娜李刚李伟张坤史利军哈小琴胡永浩
- 关键词：减蛋综合征病毒环介导等温扩增
- 犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化被引量：2
- 2009年
- 参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPV VP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,获得重组质粒pGM-T-VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a-VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E.coli Rosetta(DE3)中,获得了基因工程菌株E.coli Rosetta(CVP2),并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E.coli Rosetta(CVP2)以包涵体形式表达出了CPV-YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。
- 张坤马丽娟李刚黄伟李伟贾凤琴
- 关键词：犬细小病毒原核表达纯化
- 减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析
- 2010年
- 根据减蛋综合征病毒(EDSV-76)AV-127株的全基因序列(序列号BK000404),用Premier5.0软件设计22对引物,利用PCR方法对EDSV-76病毒NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定,并用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,将该序列与GenBank中已登录的相应序列进行同源性分析,并用六邻体蛋白构建进化树.结果表明:NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比,核苷酸序列同源性为99.6%.碱基的插入或缺失主要在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端1/10处插入了1个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端.蛋白同源性分析表明,EDSVNE4株主要蛋白与羊腺病毒OAV(Ovine adenovirusD)、牛腺病毒BAV(Bovine adenovi-rusD)和蛇腺病毒SAV(Snake adenovirus)有较高的同源性,而与禽腺病毒Ⅰ群(CELO)的同源性较低,说明NE4株与禽腺病毒Ⅰ群亲缘关系较远,进化树分析也证实了此特性.
- 董春娜李刚邱文英张坤哈小琴
- 关键词：减蛋综合征病毒基因组同源性
- 狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立被引量：8
- 2013年
- 目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。
- 宫苗苗曾妮程朝飞李刚
- 关键词：狂犬病病毒基质蛋白原核表达蛋白纯化酶联免疫吸附试验
- 狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用被引量：4
- 2010年
- 目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。
- 赵刚李刚陈铁桥范晓娟
- 关键词：P基因原核表达
- 狂犬病病毒G基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的初步建立与应用被引量：1
- 2011年
- 目的以重组G蛋白为检测抗原,应用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank公布的狂犬病病毒LEP-Flury株基因序列设计引物,PCR扩增出目的基因,连接pGM-T载体,重组质粒经BamH I和XhoⅠ双酶切,连接到表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达载体pGEX-G。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的蛋白,表达蛋白纯化后SDS-PAGE电泳分析并经Western blotting鉴定。纯化的G蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA方法检测93份犬血清抗体。结果成功构建了克隆载体pGM-G和表达载体pGEX-G,高效表达了狂犬病病毒G蛋白,融合蛋白分子量大小为79kDa,表达蛋白可与狂犬病病毒抗血清发生特异性反应。建立的检测方法灵敏度达到1∶1 600,与商品化的试剂盒相比符合率为96.8%。结论成功表达狂犬病病毒G蛋白,表达产物可作为检测抗原用于间接ELISA方法中狂犬病病毒抗体的检测。
- 王净李刚史利军邱文英曾妮穆秀明高志花王慧文
- 关键词：狂犬病病毒G蛋白间接ELISA
- 犬细小病毒北京分离株VP2基因克隆及变异分析被引量：6
- 2011年
- 对北京昌平地区分离的9株犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)进行VP2基因克隆测序,并利用生物信息学软件,将克隆的VP2基因与GenBank公布的国内外部分毒株序列相比较,绘制系统进化树,分析9株CPV VP2蛋白亲水性和抗原指数。结果表明,分离毒株与参考毒株核苷酸和氨基酸同源率在97%以上。通过序列比对与分析,确定其中有8株为New CPV-2a,1株为CPV-2,表明该地区目前主要以New CPV-2a流行为主。9株分离株在进化树上都能找到亲缘关系较近的毒株,没有形成新的分支。9株VP2蛋白亲水性高的区域抗原指数相应就高,不同株之间总体差别很小,主峰相同。
- 王净李英俊李刚史利军
- 关键词：犬细小病毒VP2基因
- 犬细小病毒环介导等温扩增快速检测方法的初步建立被引量：7
- 2010年
- 为建立犬细小病毒(CPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,实现CPV的早期快速诊断,本研究根据GenBank登录的CPV VP2基因序列,在其序列保守区域设计LAMP引物,利用CPV基因组DNA为模板进行扩增。结果表明:LAMP方法检测灵敏度达到10-1TCID50/mL;并且与其它细小病毒等无特异性扩增,表现出良好的特异性。与PCR技术相比,LAMP法操作更加简单方便,更适合基层和实验室的快速检测。
- 张坤马丽娟张乃生李刚邢国栋史利军李伟
- 关键词：犬细小病毒环介导等温扩增
- 狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用
- 根据GenBank发表的狂犬病病毒（Rabies Virus,RV）LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过。RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性...
- 赵刚李刚范晓娟
- 关键词：P基因原核表达间接ELISA
- 文献传递
