江苏省自然科学基金(BK2004057)
- 作品数：10 被引量：20H指数：3
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- 相关机构：扬州大学扬州市妇幼保健院南京医科大学更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家科技重大专项江苏省重点学科建设基金更多>>
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- LDH法检测pcDNA-HPV16L1免疫小鼠CTL活性的研究
- 2007年
- 目的观察pcDNA-HPV16L1免疫BALB/c小鼠细胞毒性T细胞(CTL)活性变化,建立简便易行的CTL检测体系,为人乳头瘤病毒(HPV)疫苗免疫中CTL作用的研究奠定基础。方法用pcDNA-HPV16L1转染的小鼠黑色素瘤B16细胞作为靶细胞,用pcDNA-HPV16L1免疫BALB/c小鼠(观察组)并以乳酸脱氢酶(LDH)法检测其CTL活性,设空质粒组与空白组作为对照(分别肌注空质粒和葡萄糖)。结果与空质粒组和空白组比较,观察组CTL活性显著增强。结论pcDNA-HPV16L1免疫小鼠的CTL活性增强,LDH法可稳定检测。
- 高慧王琴成蓓朱晓芳毕志刚
- 关键词：细胞毒性T淋巴细胞BALB/C小鼠
- HPV16 E6E7抗原表达模型的建立
- 2009年
- 目的用基因重组技术构建pcDNA-E6E7真核表达载体。方法经限制性内切酶和序列分析,用脂质体转染技术将其转入B16细胞,G418稳定筛选后IFA法检测其表达,RT-PCR法检测HPV16E6E7mRNA的生成,并将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤情况。结果酶切鉴定证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体大小、方向和插入位点均正确,在转染的B16细胞中可见绿色荧光并检测到HPV16E6E7mRNA的生成,接种的转染细胞在小鼠皮下100%成瘤。结论提示B16细胞转染E6E7后其致瘤性与转染空载体组和野生型B16细胞组无明显差异。
- 高慧朱晓芳翁晓芳周敏谢铮
- 关键词：HPV16E6E7基因转染肿瘤模型
- 地方株HPV16L1基因诱发的小鼠体液免疫反应
- 2005年
- 目的检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因疫苗诱导的体液免疫反应。方法采用PCR技术从宫颈癌组织中获得L1基因,以pGEM-T Easy为克隆载体构建重组质粒 pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体 pcDNA3．1(-)中,构建地方株HPV16L1基因疫苗,转染COS-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达。用pcDNA-L1肌肉内注射方法分别于第1天、第15天和第43天免疫6周龄BABL/c小鼠, 在特定时间段采血分离血清,IFA分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答,设pcDNA载体对照。结果 pcDNA-L1能够在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠后能检测出特异的抗体,用IFA方法在第一次免疫后的第30、60和180天均可检测到抗体;原载体免疫后未检出特异抗体。结论本实验构建的地方株HPV16L1基因疫苗可诱导产生特异性的体液免疫反应。
- 高慧孙强黄正芳吴宝金李厚达
- 关键词：HPV16L1基因体液免疫小鼠
- 人乳头瘤病毒16E7DNA疫苗微针给药效果研究被引量：1
- 2008年
- 目的探讨DNA疫苗微针给药方法的有效性。方法构建pcDNA3．1-HPV16E7重组质粒，在体外透皮条件下，观察pcDNA—HPV16E7皮肤透过量，再利用微针给药方式免疫BALB／c小鼠，分三组（实验组、空载体对照组、阴性对照组），每组10只，每2周免疫1次，共3次，每次免疫剂量为200μg／只，对照组参照实验组进行，最后1次免疫后2周采血，分别分离血清和淋巴细胞，用间接免疫荧光试验检测小鼠的体液免疫功能，用淋巴细胞转化试验检测小鼠的细胞免疫功能。结果体外透皮试验显示DNA疫苗微针给药可以透过皮肤，而且透过量随着时间的延长而逐步增加，在第30小时时可以达到0．73819mg／cm^2；通过微针给药方法DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性抗体，淋巴细胞转化试验显示：实验组（平均淋巴细胞转化率为47．25％）和阴性对照组（平均淋巴细胞转化率为30．00％）之间比较，Χ^2=12．903，P〈0．001，差异有显著统计学意义；空载体组（平均淋巴细胞转化率为43．00％）和阴性对照组之间比较，Χ^2=7．292，P=0．007，差异有显著统计学意义；实验组和空载体组之间比较，Χ^2=0．817，P=0．366，差异无统计学意义。结论HPV16E7DNA疫苗经微针给药可以透过皮肤吸收并诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应。
- 高慧潘金春陈兵薛整风李厚达
- 关键词：疫苗DNA投药途径
- 地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应被引量：2
- 2005年
- 高慧孙强黄正芳吴宝金李厚达
- 关键词：地方株抗体反应免疫小鼠限制性核酸内切酶HPV16L1COS-7细胞
- 扬州地方株HPV16L1基因的克隆及序列分析被引量：5
- 2005年
- 目的 :了解扬州地方株HPV16L1基因结构特点 ,为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 :从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA ,用PCR技术获得HPV16L1基因 ,以pGEM Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM T L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果 :扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有 7处不同 ,其中 4处由于核苷酸的改变 ,其编码氨基酸也相应发生变化 ,与标准株的同源性为 99.7% ;扬州地方株与中国株之间也存在 1至 2处核苷酸不同 ,但未造成氨基酸序列改变 ,其同源性为 99.9%。结论 :扬州地方株HPV16L1基因与标准株、中国株之间均存在差异 ,但与后者的差异极小 ,未造成氨基酸改变。
- 高慧黄正芳徐向明孙强殷俊杨玲贾筱琴朱洪李厚达
- 关键词：HPV16L1基因地方株宫颈癌组织中国株
- 地方株HPV16 L1基因免疫保护性研究
- 2006年
- 人乳头状瘤病毒（human papillomavims，HPV）至今已鉴定的HPV型超过200个，约40个型能感染生殖道，以性接触方式传播。分子流行病学证据显示HPV是引起浸润性宫颈癌和宫颈上皮内癌的主要原因，其中HPV16型在宫颈癌中检出率最高，约50％的宫颈癌患者肿瘤组织能被检测到，HPV16也是我国妇女宫颈癌的主要型别。因为HPV感染性疾病的难治性、复发性和潜在致癌性，研制开发安全、有效的HPV疫苗有一定的实用意义。
- 高慧王琴成蓓李厚达
- 关键词：HPV16型基因免疫地方株浸润性宫颈癌宫颈上皮HPV疫苗
- 地方株HPV16E7基因疫苗诱发的小鼠免疫反应被引量：2
- 2006年
- 目的评价地方株HPV16E7基因疫苗诱导的免疫反应。方法从先期构建的地方株HPV16E7基因重组质粒pGEM-T-E7经限制性核酸内切酶酶切,获得E7基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建地方株pcDNA-E7基因疫苗,转染CHO细胞,通过IFA试验验证E7蛋白的表达。用pcDNA-E7肌注方法免疫6周龄BALB/c小鼠,同时设pcDNA空载体为阴性对照,于第1天、第15天和第43天共免疫3次,用IFA和MTT法分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答。结果pcDNA-E7免疫小鼠后能检测出特异的抗体,而原载体免疫后不能产生特异抗体;但2组刺激淋巴细胞增殖的能力差异不显著。结论地方株HPV16E7基因疫苗可诱导产生小鼠免疫反应。
- 高慧孙强黄正芳陈兵李厚达
- 关键词：基因
- 扬州地方株HPV16 E7基因的克隆及序列分析被引量：7
- 2005年
- 目的了解扬州地区HPV16E7基因结构特点。方法从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16E7基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-E7,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果扬州地方株HPV16E7基因与已报道的标准株(德国)仅在核苷酸序列上有一处突变,即199位的T→C,密码子由TTG变为CTG,而氨基酸序列未发生改变;与其他国家报道的HPV16E7核苷酸序列也存在一定差异,但同源性均在98.7%以上。结论扬州地方株HPV16E7基因的成功克隆,将丰富我国HPV16感染的流行病学资料,为HPV疫苗研制奠定基础。
- 高慧韩秋萍黄正芳陈兵李厚达
- 关键词：E7基因地方株限制性核酸内切酶核苷酸序列分析HPV16感染标准株
- 人乳头瘤病毒16 E6/7转基因小鼠模型的建立被引量：4
- 2007年
- 目的构建pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,通过显微注射法建立HPV16 E6/7转基因小鼠模型。方法应用基因重组技术,构建pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,将经线性化的包含启动子、目的基因、PolyA尾的完整的真核表达DNA,通过将外源基因显微注射到供体小鼠受精卵的雄原核中,再植入到假孕受体鼠的输卵管中,获得129只F0代小鼠.常规法提取这些转基因小鼠的基因组DNA,进行PCR分析,得到5只原代转基因小鼠,再进行DNA印迹分析,其中4只小鼠的DNA出现与阳性质粒对照类似的特异条带,说明E6/7整合在这4只小鼠的基因组中。将Founder小鼠与正常FVB配种,后代经PCR检测,统计结果符合孟德尔遗传定律,证明外源基因稳定遗传给后代。在4只5月龄F_0代阳性转基因小鼠中有2只小鼠耳朵皮肤出现不典型增生改变。结果成功构建了pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,用包含CMV启动子、HPV16 E6/7目的基因转基因的小鼠已出现皮肤组织不典型增生。结论获得可繁殖传代的整合了HPV16 E6/7基因的转基因小鼠模型。
- 高慧黄正芳王琴李厚达毕志刚
- 关键词：乳头状瘤病毒小鼠转基因微量注射
