重庆市自然科学基金(2007BB5045)
- 作品数：8 被引量：31H指数：4
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- Akt3基因在低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞体外增殖中的作用被引量：1
- 2008年
- 目的通过观察缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(Akt3)mRNA及其蛋白表达水平变化与低氧PASMC增殖的关系,探讨Akt3在低氧肺血管重建中的调控作用。方法组织块法培养PASMC。采用半定量RT-PCR技术检测常氧组(N组)和低氧2、8、12、24h组Akt3基因mRNA表达水平;采用Westernblot技术检测相应蛋白表达水平。采用MTT法、3H-TdR掺入法检测PASMCs增殖改变。结果低氧诱导PASMCs不断增殖。各组均检测出Akt3基因mRNA以及蛋白表达变化,图像定量分析光密度值显示各组表达mRNA以及蛋白表达与细胞增殖改变密切相关。结论Akt3基因可能在低氧肺动脉高压中调节PASMC增殖。
- 易斌钱桂生白莉王关嵩
- 关键词：平滑肌细胞
- 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的研究进展被引量：8
- 2010年
- 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是细胞生长和增殖的重要调节因子。大量研究显示mTOR信号途径调控异常与细胞增殖密切相关。文中就mTOR基因及其靶基因,以及涉及的相关信号途径等方面进行综述。
- 国斌易斌鲁开智
- 关键词：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号途径细胞增殖
- 低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞中PTEN／Akt1表达的变化与细胞增殖的关系被引量：7
- 2008年
- 目的通过观察低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）与细胞张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶（PTEN）和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶1（Akt1）mRNA及其蛋白表达水平的变化与低氧PASMC增殖的关系，探讨PTEN／Akt1信号途径在低氧肺血管重建中的可能调控作用。方法用组织块法培养PASMC。采用半定量逆转录-PCR技术检测常氧组、低氧2、8、12、24h组PTEN、Akt1基因mRNA的表达水平，采用Western blot技术检测相应的蛋白表达水平。采用噻唑蓝比色法和氚-胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H—TdR）掺入法检测PASMC的增殖改变。数据用x±s表示，采用Excd 2003软件进行t检验，P〈0．05为差异有统计学意义。结果低氧刺激PASMC不断增殖，^3H-TdR法检测的吸光度值低氧12h组（0．70±0．10）比常氧组（0．37±0．06）明显增高（t=14．29，P〈0．01）；噻唑蓝法检测的吸光度值低氧24h组（11208±679）比常氧组（8374±545）明显增高（t=19．56，P〈0．01）。各组均检测出PTEN、Akt1基因mRNA及蛋白表达的变化。常氧组Akt1的mRNA、总蛋白、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0．76±0．09、25±6和48±8，随着低氧培养时间延长，吸光度值逐渐升高，低氧8h组达到高峰，分别为1．05±0．09、41±7和79±14，与常氧组比较，差异均有统计学意义（t值为8．31—168．00，P〈0．05和P〈0．01），随后开始下降，低氧24h组恢复至常氧组水平。常氧组PTEN的mRNA、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0．25±0．06和98±8，并随着低氧培养时间延长而逐渐升高，低氧24h组达到高峰，分别为0．38±0．05和232±12，与常氧组比较，差异均有统计学意义（t值分别为22．04和50．46，均P〈0．01）。结论PTEN／Akt1的转录和激活与低氧肺血管重建的PASMC增殖密切相关。
- 易斌钱桂生白莉王关嵩
- 关键词：蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶
- 蛋白激酶GIa基因在蛛网膜下腔出血后对血管调控作用的研究被引量：2
- 2010年
- 目的观察血性脑脊液对大鼠脑动脉平滑肌细胞(CASMC)的促增殖作用以及携带蛋白激酶GIa(PKGIa)基因的重组腺病毒载体(Ad-PKGIa)的干预作用,探讨PKGIa基因在蛛网膜下腔出血后继发慢性脑血管痉挛分子机制中可能的调控作用。方法相同密度(10~6/cm^2)接种后分为血性脑脊液组(B组)、生理盐水转染组(AN组)、血性脑脊液空载体组(KB组)和血性脑脊液转染组(AB组)。另设生理盐水对照组(N组)。采用组织块法原代培养CASMC。采用RT-PCR和Western blot检测Ad-PKGIa转染CASMC后PKGIa基因的表达。采用MTT法、~3H-TdR掺入法检测血性脑脊液对CASMC增殖的刺激作用以及Ad-PKGIa的抑制作用。结果与转染前比较,Ad-PKGIa转染后1 d,CASMC内PKGIa mRNA水平和蛋白表达明显增高(P<0.05)。与N组比较,B组、KB组~3H-TdR和MTT明显增多和升高(P<0.05);与B组比较,AN组和AB组~3H-TdR和MTT明显减少和降低(P<0.05);与KB组比较,AB组~3H-TdR和MTT明显减少和降低(P<0.05)。结论 PKGIa信号途径在蛛网膜下腔出血后,继发慢性脑血管痉挛分子机制中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一。
- 罗春霞易斌陈志唐卫华刘智冯华
- 关键词：蛛网膜下腔出血脑动脉蛋白激酶类转染
- 野生型蛋白激酶GIα腺病毒抑制低氧肺动脉平滑肌细胞表型转换及细胞增殖被引量：4
- 2010年
- 目的 观察携带野生型蛋白激酶GIα腺病毒（Ad-PKGIα）抑制低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞（PASMC）表型转换及其增殖的影响,探讨其在低氧肺血管重建（HPVR）中的作用.方法 组织块法建立人PASMC细胞系.Ad-PKGIα转染PASMC;采用荧光显微镜观察转染效率;RT-PCR、Western blot检测PASMC中PKGIα mRNA表达、Ad-PKGIα转染对低氧PASMC表型转换中平滑肌α肌动蛋白（SM-α-actin）表达的影响.流式细胞仪检测Ad-PKGIα转染后低氧对PASMC细胞周期的影响;~3H-TdR掺入法检测PASMC增殖.结果 （1）Ad-PKGIα转染后PASMC中PKGIα mRNA水平、磷酸化PKGIα蛋白水平显著增高.（2）常氧时PASMC中SM-α-actin蛋白表达为44.25±5.34;3% O_2处理12 h PASMC中SM-α-actin蛋白表达水平降至32.18±4.19,处理24 h SM-α-actin蛋白表达水平降至21.90±2.44.（3）低氧条件下,PASMC开始增殖,随着低氧时间延长,PASMC增殖逐渐增加,至24 h PASMC增殖最多[（14 924±1491）次/min].与未转染对照组、腺病毒空载体组比较,Ad-PKGIα转染组PASMC增殖明显受到抑制.（4）低氧使未转染对照组和腺病毒空载体组的PASMC进入有丝分裂期,随着低氧时间延长,G0/G1期细胞比例逐渐减少,S＋G_2/M期细胞比例逐渐增加.Ad-PKGIα转染后常氧状态下PASMC G0/G1期细胞比例下降、S＋G2/M期细胞比例上升趋势均明显减缓.结论 PKGIα基因在低氧肺血管重建信号转导途径中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一.
- 易斌陆俊羽白莉王关嵩钱桂生
- 关键词：蛋白激酶类腺病毒科
- 肝肺综合征大鼠血清对肺微血管内皮细胞Akt表达的影响被引量：9
- 2010年
- 目的探讨肝肺综合征（HPS）大鼠血清对肺微血管内皮细胞（PMVECs）丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）表达的影响。方法健康3～4月龄SD大鼠30只，雌雄不拘，采用慢性胆管结扎法制备HPS模型。另取正常大鼠，原代培养、纯化及鉴定PMVECs。PMVECs接种于低糖DMEM培养基（106，cm^2）或96孔培养板（200μl/孔），随机分为2组：对照组（C组）和HPS组，每组24皿或90孔，C组不予处理，HPS组加入HPS大鼠血清，血清终浓度为10％。于HPS大鼠血清中孵育24、48和72h（T1-3）时分别采用RT-PCR法和Western blot法检测Akt。mRNA、A地mRNA和AkhmRNA及其蛋白的表达，采用MTY法和^3H-Tdn掺人法检测PMVECs增殖情况。结果与c组比较，HPS组PMVECs增殖增强，Akt蛋白及其mRNA表达水平上调（P〈0．05）；与L时比较，T2．3时HPS组PMVECs增殖增强，Akt蛋白及其mRNA表达水平上调（P〈0．05）；与T2时比较，T3时HPS组PMVECs增殖增强，Akt蛋白及其mRNA表达水平上调（P〈0．05）。结论Akt可能参与了HPS大鼠PMVECs增殖的调节。
- 国斌易斌徐顺贵鲁开智
- 关键词：内皮细胞蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶肝肺综合征
- 蛋白激酶GIa基因在血性脑脊液致大鼠脑动脉平滑肌细胞增殖中的作用
- 2010年
- 目的观察血性脑脊液对大鼠脑动脉平滑肌细胞蛋白激酶GIamRNA及其蛋白表达水平变化与增殖的关系,探讨蛋白激酶GIa基因在蛛网膜下腔出血后继发慢性脑血管痉挛分子机制中的调控作用。方法组织块法原代培养脑动脉平滑肌细胞。采用半定量逆转录多聚酶链反应技术检测对照组、血性脑脊液处理24h组、血性脑脊液处理48h组蛋白激酶GIa基因mRNA的表达水平;采用蛋白质印迹技术检测相应的蛋白的表达水平。采用甲基噻唑基四唑法、氚标记胸腺嘧啶核苷掺入法检测脑动脉平滑肌细胞增殖改变。结果血性脑脊液诱导脑动脉平滑肌细胞不断增殖。各组均检测出蛋白激酶GIa基因的mRNA以及蛋白表达的变化,图像定量分析光密度值显示各组表达的mRNA以及蛋白表达与细胞增殖改变密切相关。结论蛋白激酶GIa基因可能在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中调节脑动脉平滑肌细胞增殖。
- 罗春霞易斌陈志唐卫华冯华
- 关键词：蛋白激酶G脑血管痉挛蛛网膜下腔出血
- 携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定被引量：5
- 2009年
- 目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack-PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。
- 易斌陆俊羽白莉王关嵩钱桂生
- 关键词：腺病毒载体基因克隆DNA重组
