国家自然科学基金(31100657)
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
- 相关作者：王文敬黎诚耀吴静波丘金浪邱菲更多>>
- 相关机构：南方医科大学安徽农业大学中国科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划广东省大学生创新实验项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 羊布鲁杆菌M5-90BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5—90BP26抗原单克隆抗体，并对抗体进行鉴定。方法将质粒pET-28a—BP26转化感受态大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3），构建原核表达质粒pET-28a—BP26，用镍离子金属螯合亲和层析法（Ni—NTA）纯化、重组BP26蛋白（rBP26）。将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原。按每只100μg／0．1ml在BALB／c小鼠皮下多点注射进行初次免疫；2周后，按每只50μg／0．1ml在小鼠皮下多点注射进行再次免疫。再次免疫后2周，小鼠尾静脉取血测效价，检测免疫效果；在细胞融合前3天，将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫。将小鼠骨髓瘤SP2／O细胞与脾细胞按1：5比例在聚乙二醇（PEG）1450作用下进行细胞融合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；10d后取细胞培养上清液，用间接酶联免疫吸附法（ELISA）测定，筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞；再经过反复3次克隆，筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株，用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体，并以初始杂交瘤细胞克隆号命名。利用羊布鲁杆菌M5～90疫苗株制备膜蛋白提取物（NMP），采用免疫印迹法（Western）及斑点间接酶联免疫吸附法（Dot—ELISA）对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定，用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa（K）和Lambda（入）轻链鉴定。结果成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体，并能与羊布鲁杆菌M5—90疫苗株上的NMP结合，构建成M5—90BP26抗原单克隆抗体，抗体亚型分别为IgG1和IgG2b，轻链均为K链。结论鉴定结果表明，成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体，抗体具有识别M5—90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力，优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5—90疫苗株的改造提供实验依据。
- 丘金浪吴静波黎诚耀王文敬
- 羊布鲁菌OMP31蛋白基因表达及抗原性分析被引量：3
- 2013年
- 目的构建布鲁菌OMP31蛋白原核表达载体,获得OMP31蛋白。方法 PCR扩增OMP31基因,连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP31质粒,双酶切鉴定、测序正确后,转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并通过二十烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析;蛋白质免疫印迹(western blot)初步分析其免疫原性。结果成功构建pET-30a(+)/OMP31表达载体,并表达出OMP31蛋白,分子量约为31 kDa,主要以包涵体形式存在;通过复性获得>95%的高纯度可溶性蛋白;以布鲁菌虎红平板阳性血清检测,显示复性后蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功表达出带组氨酸(HIS)标签的OMP31融合蛋白,且具有较好的蛋白抗原性。
- 吴静波丘金浪逯光文许翔邱菲黎诚耀王文敬
- 关键词：布鲁菌表达载体构建蛋白表达抗原性
- 布鲁氏菌弱毒疫苗株M5-90 BP26和OMP31蛋白T细胞表位的鉴定
- 布鲁氏菌为胞内寄生菌,而CD4+/CD8+细胞分泌的高水平IFN-γ等细胞因子能有效抑制胞内寄生菌;另外CTL的细胞毒作用和Th1型细胞免疫应答,对诱发长效抵抗布菌感染也是至关重要;BP26和OMP31蛋白为布菌疫苗中的...
- 吴静波翁云层丘金浪李荣黎诚耀王文敬
- 关键词：布鲁氏菌T细胞表位
- 文献传递
- 西尼罗病毒前膜蛋白在果蝇细胞S2中的表达与鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的克隆西尼罗病毒(WNV)前膜蛋白(prM)基因,将其在果蝇细胞(S2)中表达,为制备研制诊断试剂所需的单克隆抗体奠定基础。方法以质粒WNV-CME为模板,PCR扩增获得prM基因,与T载体连接,测序正确后酶切,酶切产物与果蝇表达载体pMT/Bip/V5-HisC重组,重组质粒与pCoBlas共转染果蝇S2细胞,25μg/ml Blasticidin筛选获得抗性细胞,500μmol/L CuSO4溶液诱导表达,72h后收集细胞与细胞上清进行Western blot鉴定。结果酶切与测序结果表明成功构建重组表达载体WNV-prM-pMT,Western blot显示目的蛋白在果蝇细胞S2内稳定表达。结论在果蝇S2细胞内成功地稳定表达WNV prM蛋白,为下一步WNV单克隆抗体的制备奠定了实验基础。
- 李林海杜鹏陈丽丹王文敬石玉玲黎诚耀
- 关键词：西尼罗病毒
