国家自然科学基金(30070670)
- 作品数：13 被引量：37H指数：3
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- 中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫被引量：1
- 2002年
- 目的 检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法 采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果 RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论 两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。
- 晏菊芳鲍朗胡昌华李学敏张会东
- 关键词：膜蛋白基因钩端螺旋体DNA疫苗特异性抗体
- 多耐药临床分离株结核分支杆菌耐药基因rpsL的克隆表达及功能的初步研究
- 2005年
- 制备多耐药临床分离株结核分支杆菌基因组DNA,PCR扩增其耐药基因rpsL基因和rrS基因,同时进行测序分析,结果显示该株多耐药临床分离株结核分支杆菌的rpsL基因的93、94bp处的碱基发生了突变,碱基C、C突变为T、T,使得相对应的编码氨基酸由脯氨酸(Pro)突变为亮氨酸(Leu);而rrS基因未发生核苷酸的插入、缺失或取代;进一步构建该株多耐药临床分离株结核分支杆菌耐药基因rpsL高效原核表达重组载体pGEX-λT/rpsL,所构建的重组质粒pGEX-λT/rpsL在大肠杆菌中高效表达了38kD的融合蛋白.结果提示,该株多耐药临床分离株结核分支杆菌对链霉素耐药仅仅是由于rpsL基因的个别碱基突变,是单基因型的,在国内外属首次研究发现.
- 张万江鲍朗邓喜玲吴芳曹旭东王晓樱
- 关键词：结核分支杆菌克隆
- 致病钩端螺旋体特异消减片段的序列测定与分析被引量：1
- 2004年
- 对24个已鉴定的赖型致病钩端螺旋体特异消减片段进行DNA序列测定和生物信息学分析.结果显示,片段两端皆含有AluⅠ酶切位点,片段大小为149～1506bp,平均480bp,GC含量平均为36 63%.其中6个序列无任何同源匹配序列,提示可能来自新基因;18个同源序列可分为两类:与外膜蛋白或假想蛋白相关,与生化代谢修饰相关的酶.在Genbank中登记其中20个序列,序列号分别为AF300873-AF300877,AF325807-AF325821.这些基于生物信息学的功能预测,将有助于在此基础上进行相关的基因克隆鉴定、表达分析及功能验证.
- 胡昌华鲍朗毕小君
- 关键词：钩端螺旋体生物信息学
- 利用抑制消减杂交技术研究钩端螺旋体致病相关基因被引量：16
- 2001年
- 目的 利用抑制消减杂交技术 (SSH) ,比较致病与非致病钩端螺旋体 (简称钩体 )之间基因组差异 ,筛选致病钩体特有的基因片段。方法 以赖型 0 1 7株为tester,非致病性patocⅠ株为driv er,选择合适的四碱基内切酶将基因组酶切 ,连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR ,得到消减混合物 ,与T/A克隆载体连接 ,转化JM1 0 9建立差异消减文库 ,经PCR和Southernblot筛选鉴定阳性克隆 ,进而对部分片段进行测序和同源分析。结果 AluⅠ适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段 ;经SSH筛选鉴定得到 3 0个片段大小为 2 0 0～ 1 3 0 0bp的阳性克隆 ,部分已测序的片段中 1个与硫胺素合成蛋白高度同源 ,4个与GenBank无明显同源性 ,可能为赖型致病钩体所特有而非致病钩体缺失的基因片段 ,已被GenBank收录 ,收录号分别为AF3 0 0 873～ 3 0 0 877。结论 SSH是一种有效、灵敏、高特异的比较分析基因组差异的方法 ,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义。
- 鲍朗胡昌华李学敏晏菊芳张万江张会东
- 关键词：钩端螺旋体抑制消减杂交
- 中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性被引量：2
- 2005年
- 将Omp L17基因克隆于p GEX- 1λT载体,在大肠杆菌JM10 9中表达分子量约为5 4 KDa的GST-Omp L17融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约2 8KDa的Omp L17蛋白。用纯化的Omp L17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1∶4 896 )。本研究获得了纯化的Omp L17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础。
- 朱庆平赵计林鲍朗张会东赵明才黎光
- 关键词：GST融合表达免疫原性赖型钩端螺旋体新基因特异性抗体
- 赖型钩端螺旋体外膜蛋白真核表达载体构建及表达的初步研究
- 2002年
- 目的 测定所克隆的强毒力赖型钩端螺旋体OmpL1基因的序列 ,构建能够在哺乳动物细胞中表达赖型钩体OmpL1外膜蛋白的重组质粒。 方法 首先对自行构建的含有赖型钩端螺旋体OmpL1基因的重粗质粒 pAC -OmpL1进行插入片段的序列分析 ,然后将该质粒略作修改 ,使更适于在真核细胞中表达目的蛋白 ,同时将OmpL1基因亚克隆入另一个质粒pcDNA3中 ,采用限制性内切酶分析所得质粒的正确性。最后以脂质体转染法将两个重组质粒转入COS7细胞 ,以RT -PCR分析导入质粒的表达。结果 pAC -OmpL1中插入的赖型钩体OmpL1基因全长 96 0bp ,具有完整的阅读框架 ,与流感伤寒型钩体OmpL1基因同源性达 88%。限制性内切酶分析显示 ,质粒pAC -OmpL1的修改已达目的 ,OmpL1基因也按正向插入到pcDNA3中。RT -PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ,而空白质粒载体组无此条带。 结论 赖型钩端螺旋体OmpL1基因与流感伤寒型的高度同源 ,该基因已成功地插入到两个真核表达质粒载体中 。
- 晏菊芳鲍朗胡昌华李学敏张会东
- 关键词：真核细胞基因序列钩体病
- 钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析
- 2002年
- 在以抑制消减杂交比较强毒株赖型钩端螺旋体017株和无毒株双曲钩体Patoc I株 的基因组差异时,获得了一系列仅存在于强毒株而无毒株缺如的差异片段.选取差异片段AF325810设计特异性引物,以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,进行巢式PCR扩增,PCR纯化产物T载体克隆,选取阳性克隆测序,进一步进行生物信息学分析,以获得强毒株赖型钩端螺旋体017株特有的毒力相关基因,DOT BLOT显示其在钩端螺旋体各株间有不同分布PCR扩增得到了产物为2kb大小的DNA片段,序列分析结果显示得到了问号钩端螺旋体赖型017株的鞭毛钩相关蛋白K基因的上游序列,为进一步探索钩端螺旋体的致病机制奠定了基础.
- 于向华鲍朗谢勇恩张会东
- 关键词：钩端螺旋体巢式PCR生物信息学
- 致病钩体表层膜蛋白新基因(Lslp)的克隆表达及免疫原性研究
- 2004年
- 克隆表达钩端螺旋体表层膜蛋白新基因Lslp并分析表达产物的免疫原性。根据前期研究得到的致病钩体新基因Lslp(GenBankAF32 5 80 7)的序列设计引物 ,在 6株致病钩体中扩增Lslp基因并测序。以BamHⅠ酶切Lslp和pGEX 1 λT ,构建重组质粒并用酶切和PCR鉴定 ,进一步在大肠杆菌中诱导表达 ,并进行免疫印迹分析 ;纯化表达产物免疫家兔 ,ELISA检测血清抗体滴度。结果显示Lslp在 6株致病钩体中均能扩增出相应片段 ,且序列同源性达到99 6 % ;构建高效原核表达重组质粒pGST LslP ,经IPTG诱导在大肠杆菌中可表达出 6 6kDGST融合蛋白 ,并能与全钩抗血清发生免疫印迹反应 ;将上述融合蛋白免疫新西兰大白兔产生 1 :5 1 2 0高滴度的IgG抗体。研究结果提示致病钩体膜蛋白新基因Lslp可在大肠杆菌进行高效表达 ,表达产物能被全钩抗血清识别 。
- 胡昌华鲍朗谢建平张会东
- 关键词：克隆钩端螺旋体基因免疫原性
- 赖型钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA的表达及其促细胞增殖效应被引量：1
- 2004年
- 目的 在大肠杆菌中表达赖型钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA ,并观察该蛋白对ANA 1细胞的增殖作用。方法 将invA基因克隆于pET32a(+)载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达带组氨酸标签的Trx InvA融合蛋白 ,经亲和层析获得纯化Trx InvA蛋白。以不同浓度的Trx InvA融合蛋白作用于ANA 1细胞 ,以四氮唑复合物 [2 ,3 bis(2 methoxy 4 nitro sulfophenyl) 5 〔(Phenylamino)carbonyl〕 2H tetrazoiumhydrixide,XTT]法检测细胞增殖的变化 ,分析InvA蛋白的细胞功能。结果 成功构建pETIN VA原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达了相对分子质量 (Mr)约为 35× 10 3的Trx InvA融合蛋白 ,该蛋白能促进ANA 1细胞的增殖。结论 表达并纯化的Trx
- 朱庆平鲍朗张会东赵计林龙洋吴悦涵赵明才
- 关键词：原核表达载体细胞增殖相关蛋白ANA钩端螺旋体
- 赖型钩端螺旋体毒力株新基因差异片段筛选和核苷酸序列分析被引量：3
- 2003年
- 目的 :筛选致病钩端螺旋体赖型 0 1 7株毒力相关基因DNA差异片段 ,并进行核苷酸及基因信息学分析。方法 :提取钩端螺旋体 0 1 7株基因组DNA ,根据抑制消减杂交 (SSH)筛选的 0 1 7株特有的 1 53bp核苷酸短片段 ,采用盒式连接半巢式PCR技术 ,扩增相邻未知序列 ,进行序列测定、分析及同源性检索 ,并进行蛋白二级结构预测。结果 :克隆获得 580bp核苷酸长度的基因片段 ,包含 4个重叠开放阅读框架 (ORF) ,在氨基酸水平上与A型化脓性链球菌 ,肺炎链球菌保守的假想蛋白高度同源。被GenBank收录 ,收录号为AF495587。结论 :本研究筛选并分析了可能是钩体毒力相关的基因片段 ,为进一步探讨该基因的生物学功能及阐明赖型钩端螺旋体致病分子机制打下了基础。
- 赵计林鲍朗张会东
- 关键词：钩端螺旋体属碱基序列基因
