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鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建被引量：7: 2010年; 为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。; 耿士忠潘志明方强胡娇陈祥焦新安; 关键词：同源重组

动物粪便沙门菌PCR检测技术的研究: 建立一种动物粪便样品中快速、特异、敏感的沙门菌检测方法。根据沙门菌肠毒素stn基因设计一对引物,对不同血清型的沙门菌和非沙门菌进行PCR检测,并对该PCR方法进行反应的灵敏度、模拟粪便样品的最低检出限测定及粪便样品的检测...; 潘志明周延庆刘蓓蓓焦新安; 关键词：沙门菌 STN PCR 粪便; 文献传递

鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用被引量：6: 2010年; 根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P<0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P>0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P<0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P>0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。; 丛秋霞耿士忠方强潘志明焦新安; 关键词：实时荧光定量聚合酶链反应细胞因子

麻鸭白细胞介素17的原核表达及鉴定被引量：1: 2011年; 为表达麻鸭白介素17(duIL-17),本研究提取ConA刺激的麻鸭脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增duIL-17基因片段,将该片段插入克隆载体pCR2.1中构建重组质粒pCR2.1-duIL17。将duIL-17基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-duIL17,将其转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。测序结果显示,duIL-17与参考序列(EU366165.1)相比较第174位碱基由C突变为T,并且为沉默突变。SDS-PAGE和westernblot分析显示,诱导表达的重组蛋白GST-duIL17主要以包涵体形式存在,分子量大小约为45ku,duIL-17与抗鸡IL-17抗体具有良好反应性。本研究为制备duIL-17单克隆抗体提供了实验依据。; 赵雯潘志明耿士忠康喜龙方强丛秋霞焦新安; 关键词：麻鸭 IL-17 原核表达免疫反应性

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析被引量：4: 2009年; 应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段。经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F。重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F)。经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%。Western blotting结果显示,在相对分子质量46ku位置有特异性条带。动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P<0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性。; 游猛潘志明耿士忠文科陈俊华张磊方强蔡雯婷焦新安; 关键词：新城疫病毒融合蛋白原核表达免疫原性

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析被引量：6: 2010年; 目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。; 马全刚潘志明游猛黄金林耿士忠李晓波顾健焦新安; 关键词：甲型H1N1流感病毒血凝素原核表达免疫反应性

嵌合鞭毛蛋白fliC/esat佐剂效应的研究被引量：1: 2011年; 目的:研究嵌合形式表达的鞭毛蛋白对结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的免疫佐剂效应。方法:用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliCi及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过重叠PCR将ESAT-6编码序列插入fliCi的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/esa。t将fliC/esat片段分别插入原核表达载体pET,构建pET-fliC/esat质粒。将ESAT-6编码序列插入原核表达载体pBCX的多克隆位点,构建原核表达质粒pBCX-esat。以质粒pET-fliC/esat及pBCX-esat分别转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导融合的嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白的表达。以抗ESAT-6 mAb HYB 076-08为一抗,通过W estern b lot鉴定嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白。以两种蛋白分别在体外刺激骨髓树突状细胞(BMDCs),通过FACS分析共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54的表达,同时用ELISA检测前炎性因子IL-12p70表达的水平。此外,以两种蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,运用ELISPOT法分析ESAT-6特异的IFNγ-及IL-4分泌细胞的产生。结果:嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均可溶性表达,相对分子质量(Mr)约为64000和39000。Western blot的结果显示,fliC/esat嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均具有良好的反应原性。与ESAT-6蛋白相比较,fliC/esat嵌合蛋白在体外能诱导BMDCs成熟。IL-12p70的检测结果显示,fliC/es-at嵌合蛋白诱导BMDCs分泌的IL-12p70明显高于ESAT-6蛋白诱导分泌的IL-12p70(P<0.01)。体内实验结果表明,嵌合鞭毛蛋白免疫组能够显著增强ESAT-6特异性免疫应答,且免疫应答趋于Th1型。结论:鞭毛嵌合表达ESAT-6抗原,能够有效地上调BMDCs共刺激分子表达,增强ESAT-6特异性细胞的免疫应答,以嵌合形式表达的鞭毛蛋白对ESAT-6抗原具有诱导Th1型免疫应答的佐剂效应。; 张辉文科黄金林胡茂志申峻松潘志明焦新安; 关键词：ESAT-6 嵌合蛋白鞭毛蛋白佐剂

沙门菌鞭毛蛋白增强新城疫病毒融合蛋白在小鼠中的免疫原性被引量：4: 2009年; 目的:分析沙门菌鞭毛蛋白对新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F蛋白)免疫原性的增强作用。方法:提取鼠伤寒沙门菌SL7207株鞭毛蛋白,将鞭毛蛋白与F蛋白以皮下注射的方式联合免疫C3H/HeJ小鼠,间隔2周免疫,共免疫3次。分别在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周采集血清,应用ELISA法测定小鼠血清抗体;在第3次免疫后2周取免疫小鼠脾脏细胞,检测IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞。结果:鞭毛蛋白与F蛋白联合免疫能诱导产生特异性的免疫应答,血清抗体水平显著高于F蛋白单独免疫组;在脾脏细胞中,检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,免疫应答以Th1型为主。结论:鞭毛蛋白与F蛋白的联合免疫,可显著增强F蛋白的免疫原性,显示出鞭毛蛋白良好的免疫佐剂效应。; 潘志明文科游猛耿士忠方强焦新安; 关键词：鞭毛蛋白融合蛋白免疫原性

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与新城疫病毒F蛋白的融合表达及免疫原性分析被引量：8: 2010年; 应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆到质粒pET30a+上,获得重组原核表达质粒pET-fliC-F,将其转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。Western blot证实重组菌表达的fliC-F融合蛋白能与小鼠抗fliC和抗F蛋白两种多抗血清发生特异性反应。动物试验显示,fliC-F融合蛋白能够刺激C3H/HeJ小鼠产生针对F蛋白的特异性血清抗体,说明原核表达系统表达的fliC-F融合蛋白具有较好的免疫原性。; 游猛潘志明耿士忠马全刚方强焦新安; 关键词：鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白新城疫病毒融合蛋白免疫原性

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国家自然科学基金(30871860)

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