黑龙江省博士后基金(LRB-05-451)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8突变型和野生型在真核细胞中的蛋白表达
- 2010年
- 目的克隆一个先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8，研究该基因野生型（wGJA8）和突变型（mGJA8）在体外真核细胞系中的表达。方法以正常人类和家系患者基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别调取wGJA8和mGJA8。构建质粒pEGFP—N1-WGJA8和pEGFP-N1-mGJA8，经双酶切测序鉴定后分别转染COS7细胞，用荧光显微镜观察蛋白表达情况，Western印迹和免疫组化法检测蛋白表达。结果目的基因wGJA8和mGJA8克隆成功，经双酶切和DNA测序证实质粒pEGFP．N1-wGJA8和pEGFP—N1-mGJA8构建成功。荧光显微镜观察到野生型蛋白和突变型蛋白在体外培养的COS7细胞内均有表达，Western印迹和免疫组化显示基因wGJA8和mGJA8在COS7细胞中均有蛋白表达。结论成功克隆出该家系致病基因wGJA8和mGJA8，完成了致病基因在真核细胞中的蛋白表达，为进一步研究该家系白内障的确切发病机制奠定了基础。
- 郑建秋刘平王建文刘建巨
- 关键词：突变型
- 先天性核性白内障家系致病基因的克隆及在真核细胞中的表达
- 2009年
- 目的克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8(mGJA8),研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位。方法从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-mGJA8重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后通过脂质体包埋转染法,用pEGFP-N1-mGJA8和pEGFP-N1质粒转染COS-7细胞,荧光显微镜观察其在COS-7细胞内的表达,采用细胞免疫组织化学法验证蛋白表达。结果经双酶切和DNA序列测定,证实致病基因mGJA8重组质粒构建成功,荧光显微镜观察在COS-7细胞上致病基因mGJA8蛋白表达,细胞免疫组织化学法显示致病基因表达蛋白在COS-7细胞中特异性表达。结论成功克隆出该家系的致病基因mGJA8,并且完成了该致病基因在体外真核细胞中的特异性表达,为进一步研究该家系的发病机制奠定基础。
- 郑建秋刘平傅松滨
- 关键词：先天性核性白内障突变型质粒
