重庆市自然科学基金(cstc2012jjA10023)
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
- 相关作者：何永林杨春徐蕾张继明张春燕更多>>
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- 结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定被引量：4
- 2014年
- 目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。
- 张继明杨春何永林穆柳青张春燕樊宇徐蕾
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达
- 重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用被引量：2
- 2013年
- 目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RD1区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein10,CFP10)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接ELISA法。方法采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白;分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接ELISA法;采用方阵滴定法对建立的间接ELISA法的条件进行优化;并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证。结果纯化的重组CFP10-PPE68融合蛋白纯度约为70%。分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的最佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清最佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗最佳稀释度均为1∶5 000。3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均最佳;3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低。结论以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值。
- 董志玲杨春徐蕾何永林冯鑫王静娴张壮苗杨晓燕
- 关键词：结核分枝杆菌酶联免疫吸附测定
- 锌依赖的金属蛋白酶1促进巨噬细胞凋亡被引量：2
- 2015年
- 目的构建锌依赖的金属蛋白酶1(zmp1)基因的真核表达质粒,探讨其对巨噬细胞凋亡的影响。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因;克隆到真核表达质粒p EGFP-N1的多克隆位点中,构建真核表达质粒p EGFP-N1-zmp1并转染RAW264.7细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测zmp1 mRNA的水平;藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7-AAD)双染色结合流式细胞术检测Zmp1蛋白对细胞凋亡影响。结果扩增出zmp1基因;真核表达质粒经过XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切及基因测序鉴定构建成功;转染细胞24 h后,经荧光倒置显微镜观察到绿色荧光;qRT-PCR结果显示转染p EGFP-N1-zmp1的RAW264.7细胞zmp1 mRNA的表达显著升高;转染后48 h,细胞早期凋亡率有所增加。结论在RAW264.7细胞中成功表达了Zmp1并能促进巨噬细胞凋亡。
- 李鹏何永林张继明方陈城
- 关键词：卡介苗真核表达RAW264.7细胞
- 佛波酯对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素表达的激活作用
- 2014年
- 目的探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor,PMA)对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素(granulysin,GLS)表达的激活作用。方法分别用不同浓度的PMA(130、160、180 nmol/L)诱导THP-1细胞24 h,RT-PCR法检测细胞中GLS基因mRNA的转录,筛选PMA最佳诱导浓度;用PMA最佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24和48 h,RT-PCR法检测GLS基因mRNA的转录,筛选最佳诱导时间;用PMA最佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24、48和72 h,Western blot法检测GLS蛋白的表达,免疫细胞化学法检测48 h时GLS蛋白的表达。结果以160 nmol/L的PMA诱导THP-1细胞24 h,细胞中GLS基因mRNA的转录水平最高;诱导48 h后可检测到GLS蛋白大量表达。结论 PMA可激活THP-1细胞中GLS的表达,本实验为后续进一步研究GLS表达的调控机制奠定了基础。
- 杨静杨春何永林徐蕾冯鑫张春燕穆柳青
- 关键词：佛波酯THP-1细胞颗粒溶素
- CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达被引量：1
- 2013年
- 目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESAT6-PPE68基因,Gene-SOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD。结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。
- 冯鑫杨静张春燕穆柳青徐蕾何永林董志玲杨春
- 关键词：结核分枝杆菌融合蛋白
