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小鼠MYSM1基因稳定敲除的间充质干细胞系C3H10T 1/2的建立及其体外免疫调节作用被引量：5: 2017年; 目的:本研究旨在构建小鼠组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1基因敲除的间充质干细胞系(mesenchymal stem cells,MSC),并初步探讨MYSM1基因敲除后MSC免疫学特性的变化。方法:通过CRISPR-Cas9技术对小鼠间充质干细胞系(C3H10T 1/2)MYSM1基因进行特异性基因敲除,再采用流式细胞术、定量PCR和蛋白印迹(Western blot)技术检测基因敲除情况。为检测MYSM1敲除对MSC免疫调节能力的影响,将MYSM1基因敲除的MSC上清加入脾脏淋巴细胞培养体系中,在镜下观察其对淋巴细胞增殖的调节作用,并进一步采用定量PCR检测淋巴细胞内炎性因子白介素4,干扰素γ、白介素17A和Foxp3的表达情况。结果:流式细胞术、定量PCR及Western blot的鉴定结果表明,CRISPR-Cas9技术稳定敲除了MSC细胞系内MYSM1基因。敲除了MYSM1基因之后的MSC上清显著抑制刀豆蛋白A诱导的淋巴细胞增殖及炎性因子分泌(P<0.05)。结论:本研究成功地构建了小鼠MYSM1稳定敲除的间充质干细胞系,同时发现MYSM1敲除后MSC体外免疫抑制作用增强,此相关发现为深入研究MYSM1基因的功能,探索基因修饰MSC对免疫相关性疾病的治疗奠定了基础。; 刘宇朱恒江小霞张斌廖丽刘元林张毅陈虎毛宁; 关键词：间充质干细胞基因敲除

供鼠周龄影响小鼠急性移植物抗宿主病发生机制分析被引量：1: 2014年; 目的研究供鼠周龄影响小鼠急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)发生的内在机制。方法采用2周龄、10周龄、18周龄C57BL/6(H-2Kb)雄性小鼠作为供鼠,8周龄的BALB/c(H-2Kd)雄性小鼠作为受鼠,建立小鼠aGVHD模型。经60Coγ射线照射后,给予模型组小鼠输注不同周龄供鼠的骨髓细胞(1×107/只)和脾细胞(1×107/只),观察各组小鼠的一般生存情况与病理学改变;采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-17A在各组小鼠脾脏表达的改变;流式细胞术分析各周龄供者小鼠骨髓造血干细胞和脾脏细胞中免疫细胞亚群所占比例。结果成功建立不同周龄供者小鼠aGVHD模型,与2周龄和10周龄供者组相比,18周龄供者组移植后一般生存情况和病理学改变最显著;Q-PCR检测结果显示,移植后第10天模型组开始出现炎性因子表达的改变,2周龄组各种炎性因子的表达量最低,18周龄组表达量最高,且组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术分析不同周龄供鼠造血干细胞含量和免疫细胞亚群的比例,结果表明,随着供者周龄的增加,骨髓中造血干细胞的含量亦减少;而脾脏细胞中成熟树突状细胞(DC)、活化T细胞则随着年龄的增长而增加,但髓源性抑制细胞则随着小鼠周龄的增长其所占比例显著下降。结论不同周龄供鼠体内造血干细胞含量和免疫细胞成分的不同是影响受鼠aGVHD发生的主要因素。; 唐博朱恒李喜梅褚亚男刘元林周凡张毅; 关键词：急性移植物抗宿主病

急性移植物抗宿主病的治疗新策略及其相关研究进展被引量：8: 2014年; 急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)是异基因造血干细胞移植后常见并发症,是目前导致造血干细胞移植后患者死亡的主要原因。以往的治疗策略主要依靠患者的临床症状及活组织病理检查,一旦患者被诊断为aGVHD,首选给予类固醇类激素治疗。但是,若激素治疗效果不佳,则病人预后往往较差。近年来,随着相关领域研究的不断深入,aGVHD的治疗方案不断优化,本文主要就aGVHD的临床特征、发病机制及最新策略,包括单克隆抗体药物治疗、物理治疗和细胞治疗等作一综述。; 唐博朱恒周凡张毅; 关键词：造血干细胞移植急性移植物抗宿主病

慢性移植物抗宿主病的发病机制及其相关问题最新研究进展被引量：5: 2014年; 异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是目前治疗造血系统各种恶性疾病或非恶性增殖性疾病的有效方法,但是移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的发生限制了造血干细胞移植的成功率,其中慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease,cGVHD)是影响造血干细胞移植后受者长期生存率和生活质量的主要因素。本文从胸腺、细胞因子、T淋巴细胞各亚群和B淋巴细胞及其分泌的抗体四个方面对cGVHD的发病机理及相关领域的最新研究进展作一综述。; 李喜梅朱恒周凡张毅; 关键词：造血干细胞移植慢性移植物抗宿主病发病机制

组织块法分离培养小鼠脾脏间充质干细胞被引量：1: 2016年; 目的通过组织块培养法,建立一种高效可靠的小鼠脾脏间充质干细胞分离扩增策略。方法无菌条件下取小鼠脾脏组织充分碾碎,使用胶原酶消化获得的脾脏基质组织,将消化后的组织块种于培养瓶中,观察从组织块中迁移出的细胞形态,采用流式细胞术分析其表型,并将其做成骨和成脂肪诱导分化。结果消化后的脾脏组织块中迁移迁移出大量梭形纤维样细胞,流式细胞术检测结果表明,该种细胞高表达CD29、CD44、Sca-1和CD105,低表达CD11b、CD34、CD45和Ia。多向分化实验结果表明:小鼠脾脏基质组织中迁移出的细胞具有较好的成脂肪和成骨分化能力。结论组织块法可以分离培养出小鼠脾脏间充质干细胞,所获得的细胞纯度高,分化能力强,为开展相关研究提供了良好的细胞模型。; 丁丽朱恒张海宏杨洋韩冬梅王志东郑晓丽董磊闫洪敏刘静朱玲薛梅郭子宽王恒湘; 关键词：细胞培养脾脏间充质干细胞

细胞间黏附分子1通过活化MAPK通路调节小鼠间充质干细胞向脂肪细胞分化: 2014年; 本研究旨在探讨细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)调节小鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)向脂肪细胞分化的分子机制。分别将小鼠ICAM-1重组逆转录病毒MIGR1-ICAM-1和空载体逆转录病毒MIGR1感染小鼠间充质干细胞系C3H10T 1/2细胞,获得稳定高表达ICAM-1的C3H10T 1/2细胞(MIGR1-ICAM-1/MSC)和对照组细胞(MIGR1/MSC)。通过Western blot检测P38,ERK和JNK通路的活化情况,观察MIGR1-ICAM-1/MSC和MIGR1/MSC向脂肪细胞的诱导分化。实验组加入P38、ERK及JNK 3种信号通路抑制剂后进行培养并观察其成脂肪分化情况。以原位油红染色观察脂滴,应用real-time PCR检测成脂分化关键转录因子C/EBPα和PPARγmRNA的表达水平。结果显示,ICAM-1过表达可活化MSC的P38、ERK及JNK通路;原位油红染色及real-time PCR检测结果显示对ERK通路活化抑制可导致MIGR1-ICAM-1/MSC的C/EBPα和PPARγ的mRNA表达水平上调,脂滴变大,脂肪数量增加(P<0.01);阻断P38通路后MIGR1-ICAM-1/MSC的C/EBPα和PPARγmRNA表达水平下调,脂滴及脂肪细胞数量更小、更少(P<0.01)。结论:ICAM-1可能通过活化ERK信号通路抑制MSC的成脂分化,通过活化P38通路维持小鼠MSC成脂分化能力。; 陈继德徐芬芬朱恒李喜梅唐博刘元林张毅; 关键词：细胞间粘附分子1 MAPK通路间充质干细胞脂肪细胞

不同浓度葡聚糖硫酸钠对小鼠炎症性肠病模型建立及其致病相关免疫因子表达的影响被引量：9: 2015年; 目的探讨饮用不同浓度的葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)对于建立小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型及其致病相关免疫因子表达的影响。方法雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组和不同浓度的DSS饮用组(3%、5%、7%)。观察小鼠的大便性状,体重和生存时间。饮用后的第6天处死各组小鼠,观察结肠大体形态并评分;取病变处进行石蜡包埋病理切片,苏木素伊红染色并进行病理组织学评分;定量PCR检测各组脾细胞免疫因子表达情况。结果饮用3%、5%、7%浓度DSS的小鼠在第6天均有不同程度溃疡形成,成模率随着DSS浓度提升而增加,但是小鼠死亡率也相应增加。定量PCR结果表明促炎因子(TNF-α、IFN-γ和IL-17A)的表达水平与DSS浓度成正相关,而抑炎因子(IL-4和IL-10)以及调节性T细胞相关的转录因子Foxp3的表达水平与DSS浓度成负相关关系。结论给予小鼠5%浓度的DSS溶液饮用有助于高效经济地建立小鼠IBD模型,为进一步研究IBD的发病机理、生物学特性、干预因素等打下了重要基础。; 李欣武文卿张卓超俎占飞毛旭燕朱恒宁守斌; 关键词：葡聚糖硫酸钠炎症性肠病小鼠模型

单倍体相合造血干细胞移植治疗幼年型粒单核细胞白血病的临床研究被引量：4: 2017年; 目的:探讨单倍体相合造血干细胞移植术(haploidentical-HSCT)治疗幼年型粒单核细胞型白血病(JMML)的效果。方法:对6例JMML接受了haploidentical-HSCT患者的造血植入、移植物抗宿主病(GVHD)发生率、并发感染、原发病复发及生存情况等临床资料进行了回顾分析。结果:6例患者全部为男性。供体均为亲缘性单倍体相合供者。接受了haploidentical-HSCT的6位患者的造血干细胞均成功植入,其中2例JMML死于移植后肺部感染,其余4例无病生存至今。3例发生急性GVHD,1例发生慢性GVHD。总体生存率66.7%,无病生存率66.7%,复发率0。结论:haploidentical-HSCT是治疗JMML的有效手段。; 丁丽朱恒韩冬梅王志东郑晓丽董磊闫洪敏刘静朱玲薛梅郭子宽王恒湘; 关键词：幼年型粒单核细胞白血病

细胞间粘附分子-1在小鼠间充质干细胞体外迁移中的作用及其机制被引量：4: 2014年; 本研究旨在探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在小鼠间充质干细胞(MSC)体外迁移中的作用及其相关机制。采用transwell法研究小鼠MSC(C3H10T1/2)、转染空载体的小鼠MSC(C3H10T1/2-MIGR1)和转染了ICAM-1的小鼠MSC(C2H10T1/2-ICAM-1)的体外迁移能力,即将各组MSC种植在孔径为8μm的通透膜上面,以胎牛血清作为趋化物质诱导MSC迁移。分别在迁移8 h和12 h后对膜下的MSC进行结晶紫和荧光染料DAPI染色,然后统计各组的MSC的细胞数和迁移率。为了探究调控MSC迁移的机制,丝裂原活化蛋白激酶通路的抑制剂(SB203580,PD98059和JNK inhibitor II)被添加到transwell体系中,并进一步观察MSC迁移能力的改变。结果表明:3种细胞8 h和12 h的transwell体外迁移结果显示,转染了ICAM-1的MSC组迁移的细胞数和迁移率均显著高于未转染组MSC和转染空载体组MSC(P<0.05),未转染组MSC和转染空载体组MSC之间无统计学差异(P>0.05);加入JNK/SAPK通路的抑制剂JNK inhibitor II可以抑制ICAM-1对MSC的促迁移作用,无论是迁移的细胞数还是迁移率均显著降低(P<0.05)。本研究中p38/MAPK通路的抑制剂SB203580和ERK/MAPK通路的抑制剂PD98059对于ICAM-1的促MSC迁移作用无显著影响。结论:ICAM-1可增强小鼠MSC的体外迁移能力,这种促进作用部分依赖于活化JNK/SAPK通路实现。; 王艳国赵岳李喜梅唐博褚亚男刘元林朱恒张毅; 关键词：细胞间粘附分子-1 间充质干细胞

悬浮培养的小鼠骨间充质干细胞对T细胞的调节作用及其机制研究被引量：1: 2016年; 目的:研究悬浮培养的小鼠骨间充质干细胞(MSC)对T细胞的调节作用及其机制。方法:采用低吸附细胞培养皿培养小鼠骨悬浮MSC,采用贴附细胞培养板培养小鼠贴壁MSC。在光学显微镜下观察悬浮MSC的形态并进行成骨和成脂肪诱导分化。应用以流式细胞术检测悬浮MSC的免疫表型。收获悬浮MSC和贴壁MSC的培养上清,采用流式细胞术检测和CFSE法比较悬浮MSC抑制T细胞增殖的能力。采用定量PCR分析不同培养上清对T细胞表达的免疫因子的影响。采用定量PCR检测悬浮MSC表达的免疫调节因子。结果:悬浮培养的小鼠骨MSC呈现为悬浮球状,具有成骨和成脂肪分化能力。流式细胞术检测结果表明,悬浮MSC高表达CD29、CD44、Sca-1和CD105,低表达CD11b、CD45、CD31和Ia。CFSE法结果提示,悬浮MSC培养上清能够抑制T细胞增殖。定量PCR检测结果表明,悬浮MSC上清能够抑制T细胞表达干扰素γ和白介素17A的表达。进一步分析发现,相对于贴壁MSC,悬浮MSC表达的白介素6和转化生长因子β1的水平较高。结论:悬浮法培养获得的MSC能够抑制T细胞增殖,其对T细胞调节作用与贴壁MSC不同。; 李欣武文卿丁丽刘元林毛宁张毅朱恒宁守斌; 关键词：间充质干细胞 T细胞免疫调节

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