国家自然科学基金(30672069)
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
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- 相关机构：西安交通大学医学院第一附属医院西安交通大学西北大学更多>>
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- SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体的构建和鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的:通过基因克隆构建表达SP-TAT-Apoptin融合基因的真核表达载体.方法:通过DNA重组技术,以pCD-NA3.1/Apoptin质粒为模板,进行PCR反应;将具有分泌功能的信号肽和能够携带核酸、蛋白和肽自由地通过细胞膜和核膜的蛋白转导域TAT序列连接于Apoptin基因5′端;PCR反应的产物连接于plenti6-V5-D-TOPO(真核表达载体.用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组结果;将重组的真核表达载体瞬时转染HUVEC细胞,用免疫荧光标记对转染后的细胞进行处理,观察重组蛋白的表达情况.结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒plenti6-V5-D-TOPO(/SP-TAT-Ap-optin双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确.且经激光共聚焦显微镜观察到重组蛋白的表达,表明重组表达载体已构建成功.结论:成功克隆出SP-TAT-Apoptin融合基因,并成功构建其真核细胞表达载体,为下一步研究SP-TAT-Apoptin融合基因对肿瘤的生长抑制作用的体内外研究奠定了基础.
- 韩苏夏马瑾璐吕毅黄辰段康民
- 关键词：信号肽蛋白转导域鸡贫血病毒
- SP-TAT-Apoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响被引量：2
- 2008年
- 目的:研究SP-TAT-Apoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法:通过DNA重组技术,以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板,构建SP-TAT-Apoptin融合基因plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体。用SP-TAT-Apoptinplenti6-V5-D-TOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),转染后Blasticidin霉素进行筛选,并进行鉴定得到稳定表达SP-TAT-Apoptin的CHO细胞株。收集含有TAT-Apoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清,用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果:用包含SP-TAT-Apoptin融合基因的plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),成功筛选出稳定表达SP-TAT-Apoptin融合蛋白的CHO细胞,收集细胞培养上清,继续用于HepG2细胞培养,可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论:SP-TAT-Apoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。
- 韩苏夏马瑾璐吕毅黄辰段康民
- 关键词：信号肽蛋白转导域鸡贫血病毒
- 慢病毒介导的融合基因SP-TAT-Apoptin对HepG2细胞的作用被引量：2
- 2010年
- 目的:将已构建的SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体包装成感染性慢病毒颗粒,并用病毒颗粒感染肝癌HepG2细胞,测定其诱导凋亡的效率。方法:通过脂质体Li-pofectamine TM2000将SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体与其他包装质粒共同转导入293FT细胞,包装并收集感染性病毒颗粒,用实时定量PCR法测定病毒滴度,免疫荧光法检测重组慢病毒感染的293FT细胞中SP-TAT-Apoptin融合基因的表达,同时通过流式细胞术(FCM)测定慢病毒感染后HepG2细胞的凋亡率。结果:SP-TAT-Apoptin重组慢病毒感染293FT细胞后,用V5抗原单克隆抗体(mAb)进行免疫荧光化学检测,示SP-TAT-Apoptin融合基因可成功表达于293FT细胞;通过Anexin-VPI法检测示SP-TAT-Apoptin融合基因慢病毒感染肝癌HepG2细胞后可引起细胞凋亡,其凋亡效率明显高于单纯脂质体转染组。结论:成功包装出可表达SP-TAT-Apoptin融合基因且具感染性的慢病毒颗粒,感染HepG2肝癌细胞后可引起其凋亡,为进一步研究融合基因SP-TAT-Apoptin体内治疗效果极其在临床中的应用奠定了基础。
- 韩苏夏赵晶马瑾璐黄辰吕毅欧玮贾茜
- 关键词：APOPTIN融合基因慢病毒细胞凋亡
