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甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理对德保猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响被引量：3: 2014年; 供体细胞的不完全重编程是动物克隆效率低的主要原因。本研究采用不同浓度(0.00(对照)、0.25、0.50和1.00μmol·L^(-1))的DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理德保猪耳成纤维细胞,将处理后成纤维细胞作供体进行手工克隆。结果显示:各处理组细胞生长曲线均呈"S"型,其中0.25μmol·L^(-1)组细胞生长曲线与对照组最相近。随着5-Aza-CdR浓度增加,细胞均有不同程度的畸变、生长抑制甚至致死。0.00~0.50μmol·L^(-1)5-Aza-CdR处理对德保猪成纤维细胞不会显著改变其细胞染色体整倍性。5-Aza-CdR不同程度下调了德保猪耳成纤维细胞中Dnmtl、Tet1、Tet2和Tet3的相对表达,对Dnmt1、Tet1和Tet3表达量的下调呈剂量相关。以处理后成纤维细胞作供体,猪手工克隆重构胚体外发育的卵裂率(24、48 h)和桑椹胚率各组间差异不显著(P>0.05),其中0.25μmol·L^(-1)组和0.50μmol·L^(-1)组囊胚发育率显著高于1.00μmol·L^(-1)组(P<0.05),而与对照组差异不显著(P>0.05)。0.50μmol·L^(-1)组囊胚细胞数显著高于对照组和1.00μmol·L^(-1)组(P<0.05),而与0.25μmol·L^(-1)组之间差异不显著(P>0.05)。综上表明:高浓度5-Aza-CdR对德保猪成纤维细胞增殖和染色体具有副作用,低浓度(≤0.25μmol·L^(-1))的5-Aza-CdR可用于供体处理以降低克隆胚胎甲基化水平及提高手工克隆猪胚胎发育潜能。; 陆杏蓉孙俊铭李志鹏李兰玉谢炳坤刘庆友石德顺崔奎青; 关键词：5-AZA-CDR 重编程

应用ICSI技术生产转基因水牛胚胎的初步研究被引量：3: 2012年; 本研究旨在探讨水牛精子完整质膜和破损质膜的方法对水牛单精子注射(ICSI)技术转基因效果的影响。水牛精子经冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜后与外源质粒DNA混合,采用ICSI的方法将基因转染后的精子注射到水牛体外成熟卵内,观察水牛ICSI卵激活后的发育状态和外源基因的表达效果。结果表明:精子质膜完整性实验中,冻融破损精子质膜组早期胚胎基因表达率为21.8%,显著高于活精子组的5.1%(P<0.01);冻融组与活精子组的卵裂率、囊胚发育率均无显著差异(P>0.05)。以冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(16.7%)最高,显著高于Triton×-100组(P<0.01)。同时,冻融组的早期胚胎基因表达率亦显著高于Triton×-100组和超声断尾组(60.3%vs.31.7%vs.18.2%,P<0.01)。上述结果说明,使用ICSI技术转外源基因可获得表达EGFP基因的水牛早期胚胎;冻融精子质膜破损法能有效破损精子质膜,有利于外源DNA与精子的结合,且提高转基因效率。; 陈自洪孟凡丽刘玉兵陆凤花王丹崔奎青石德顺; 关键词：ICSI 转基因水牛

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位: 2013年; 【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原(PCNA)参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示:原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示:PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异(43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219,P<0.01);【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。; 马帆周宇高亚可朱鹏雷小灿刘庆友石德顺; 关键词：水牛 PCNA

牛磺熊脱氧胆酸对黄牛体外受精早期胚胎发育的影响被引量：1: 2015年; 旨在研究牛磺熊脱氧胆酸(Tauro ursodeoxychollc acid,TUDCA)对黄牛体外受精(IVF)早期胚胎发育的影响。采用RT-PCR法检测黄牛IVF胚胎早期发育各时期XBP-1mRNA剪接激活情况,随后分别用添加不同浓度(0、100、250、500、1 000μmol·L-1)TUDCA的培养液培养胚胎,分别统计胚胎分裂率、囊胚率、囊胚细胞总数及囊胚细胞凋亡率,采用qRT-PCR法分析囊胚内质网应激相关基因Grp78、Chop、Bax、Bcl-2的表达情况。结果表明,在胚胎的4-细胞、桑椹胚、囊胚检测到XBP-1mRNA明显剪接;IVF胚胎经不同浓度TUDCA培养后各组间的胚胎分裂率差异不显著(P>0.05),但500μmol·L-1 TUDCA组提高了胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数(P<0.05),并降低了囊胚细胞凋亡率(P<0.05);qRT-PCR检测表明,500μmol·L-1 TUDCA处理组下调了囊胚Chop基因的表达,且上调了Bcl-2基因的表达(P<0.05),而Grp78与Bax表达与对照组相比差异不显著(P>0.05)。综上表明:早期胚胎体外发育过程中,存在内质网应激反应;胚胎培养液中添加500μmol·L-1 TUDCA,可以降低内质网应激反应,有利于促进黄牛胚胎发育。; 李政达阮子芸雷钏阮秋燕蒋建荣石德顺陆凤花; 关键词：黄牛 IVF 内质网应激基因表达

BMP1基因在动物卵泡发生和胚胎发育中的表达规律及调控机制的研究进展被引量：2: 2015年; 骨形态发生蛋白1(BMP1)是一类属于虾红素家族的金属蛋白酶,它在细胞外基质的形成以及调控TGFβ信号通路的过程中发挥重要作用。BMP1基因在动物卵泡发育过程中具有不同程度表达,并以某种形式参与了动物胚胎的发生和发育过程。开展对BMP1基因的研究将有助于人们从基因角度进一步阐明动物卵泡的形成和胚胎发育的机制,对医学和畜牧业等领域将产生积极的影响。着重从BMP1基因在动物胚胎发育过程中的表达定位、功能及其机制进行综述。; 雷小灿李兰玉李志鹏崔奎青刘庆友石德顺; 关键词：胚胎发育

水牛RNA聚合酶III启动子的克隆与鉴定被引量：1: 2014年; 【目的】获得有效的水牛RNA聚合酶III启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础。【方法】通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况。【结果】克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守。连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82%和87.45%;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P<0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P>0.05)。【结论】水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性。; 张晓溪刘庆友邓彦飞罗婵崔奎青石德顺; 关键词：水牛克隆基因沉默

不同还原剂预处理精子对水牛ICSI介导转基因效果影响的初步研究: 2014年; 本研究探讨了还原剂β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)及谷胱甘肽(GSH)预处理水牛精子对水牛ICSI介导转基因(ICSI-mediated gene transfer,ICSI-Tr)效果的影响。结果显示,β-ME、DTT和GSH预处理水牛精子对提高ICSI介导转基因的效果不显著(p>0.05),但GSH能显著提高2原核(PN)的形成率(p<0.05)。; 陈自洪孟凡丽王丹刘玉兵陆凤花刘庆友石德顺; 关键词：水牛还原剂精子

应用ICSI-Tr技术生产转Fat-1基因水牛胚胎的初步研究: 2014年; 肉质的改善是水牛未来育种的重要方向,为提高水牛肉中n-3多不饱和脂肪酸的含量,本研究探讨了应用ICSI介导技术(ICSI-Tr)生产转Fat-1基因水牛胚胎的可行性。将水牛组织性启动子PGK1、目的基因Fat-1和标记基因EGFP表达盒依次连接,成功构建获得转基因载体pPGK1-FAT1-CMV-EGFP。随后以酶切线性化的转基因载体质粒DNA为素材,探讨了5、10、25、50μg/m L和70μg/mL等5个不同浓度梯度对pPGK1-FAT1-CMVEGFP转基因效果的影响。结果表明:在不同浓度DNA试验组应用ICSI-Tr介导技术均能获得表达EGFP的转基因水牛胚胎。其中,25μg/m L为适宜浓度。; 陈自洪刘玉兵王丹孟凡丽陆凤花刘庆友石德顺; 关键词：水牛

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究被引量：2: 2013年; 本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。; 苏节朱鹏刘庆友雷小灿石德顺崔奎青; 关键词：水牛克隆

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究被引量：1: 2014年; 采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射(ICSI)介导转基因效果的影响。结果表明:线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组(19.8%,16.7%VS 7.9%,p<0.05)。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(24.7%)最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组(41%VS 20.5%,p<0.01);当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异(p>0.05),但二者之间胚胎的基因表达率差异显著(46.83%VS 28.57%,p<0.05)。以上结果表明:(1)牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;(2)精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;(3)25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。; 孟凡丽陈自洪陆凤花刘庆友罗婵张顺王丹石德顺

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国家科技重大专项(2011ZX08007-003)

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