国家自然科学基金(31201535)
- 作品数：8 被引量：32H指数：4
- 相关作者：刘媛刘贤金张霄寇莉萍徐重新更多>>
- 相关机构：江苏省农业科学院西北农林科技大学河南科技学院更多>>
- 发文基金：江苏省农业科技自主创新基金国家自然科学基金江苏省社会发展科技计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学化学工程轻工技术与工程更多>>
- 基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定被引量：1
- 2014年
- 【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol·L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为"捕获抗体",多抗为"检测抗体",建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25—2.43μg·mL-1线性检测范围内,�
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- 关键词：磁珠单链抗体
- 利用基因工程抗体建立的新型双抗夹心ELISA法检测Cry1Ac毒素被引量：1
- 2014年
- 为明确新型双抗夹心ELISA方法检测Cry1Ac毒素的效果,分别用纯化后的抗Cry1Ac单链抗体和anti-Cry1Ac兔多克隆血清(Anti-Cry1Ac-PAbs)作为捕获抗体和检测抗体,通过方阵滴定确定其最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA法。再用优化后的双抗夹心ELISA方法对检测Cry1Ac毒素的敏感性、特异性和回收率进行鉴定。结果表明,新型双抗夹心ELISA法最低检测限为0.91 ng/ml,线性检测范围为1.04 ng/ml^3.49μg/ml。5种稻米中Cry1Ac毒素的平均回收率为69.42%~87.95%,变异系数为1.19%~6.50%。
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- 关键词：基因工程抗体
- 抗Bt(Cry1B)毒素单链抗体在sf9昆虫细胞中的表达及活性测定被引量：1
- 2013年
- 通过构建pFastBacTM HT-A-scFv重组质粒,并将重组质粒化转DH10BacTM Escherichia coli感受态细胞,进行蓝白斑筛选,获得阳性克隆.PCR和基因测序检测证实挑取的白斑阳性单克隆存在完整、正确的单链抗体基因.提取阳性克隆中的重组杆状病毒穿梭载体（Bacmid-scFv）侵染sf9昆虫细胞,细胞发生明显病变特征.通过SDS-PAGE、Western blotting和间接竞争性ELISA等方法检测,发现单链抗体在sf9昆虫细胞中表达成功,测得纯化后蛋白浓度为103.000 0 μg/ml,Cry1B毒素对单链抗体的抑制中浓度（IC50）为1.010 0 μg/ml,最低检测线IC10为0.011 3μg/ml,线性检测范围为0.500 0～10.000 0 μg/ml.可溶性scFv对抗原类似物无交叉反应.
- 徐重新张霄张存政刘媛谢雅晶黄鹰刘贤金
- 关键词：单链抗体真核表达系统酶联免疫分析
- 抗拟除虫菊酯类农药广谱性单克隆抗体的研制及鉴定被引量：6
- 2014年
- 制备了抗拟除虫菊酯类农药(Pyrethroids)的广谱性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性;以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,用活性酯法将其与牛血清蛋白(BSA)偶联制得人工抗原PBA-BSA免疫Balb/c小鼠,5次免疫后选择效价最高、对PBA识别能力最强的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG1500作用下融合,经间接ELISA筛选及有限稀释法进行亚克隆,分离阳性细胞株,腹水诱导法大量制备单克隆抗体,并用Protein G亲和柱纯化,间接ELISA法测定抗体效价、亚型、亲和力常数及对拟除虫菊酯类农药的作用;UV结果显示,PBA-BSA成功偶联,获得1株稳定分泌抗拟除虫菊酯类农药单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11,其培养腹水抗体效价为1∶6.5×106,其抗体亚类为IgG1,对PBA的亲和力常数为2.5×10 L/mol,对PBA的IC50为208.9μg/L,检出限为21μg/L,对高效氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯和氯氰菊酯的IC50分别为1.01,2.15,3.16和3.67μg/L。
- 文孟棠刘媛闫帅张霄王恒刘贤金
- 关键词：拟除虫菊酯类农药单克隆抗体酶联免疫吸附法
- 大白菜中拟除虫菊酯类农药残留半定量ELISA免疫检测方法的建立被引量：12
- 2014年
- 为建立适合蔬菜中拟除虫菊酯类农药的半定量ELISA免疫检测方法,以实验室自制的针对拟除虫菊酯类农药的广谱性抗体为材料,以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,分别用活性酯法、混合酸酐法和6-氨基己酸法偶联鸡卵清蛋白(OVA)制备3种包被抗原,开展了半定量酶联免疫分析法(ELISA)免疫检测试验。结果表明,采用6-氨基己酸法合成包被抗原效果最优;检测时无需将抗原抗体过夜提前预混,抗原抗体反应时间以45 min较佳;无净化步骤的大白菜基质对检测结果影响较小,该方法对63个大白菜样品的假阳性检出率和假阴性检出率分别为9.3%和2.7%,表明该方法具备对大量大白菜样品快速初筛的应用潜力。
- 文孟棠刘媛寇莉萍刘贤金
- 关键词：拟除虫菊酯类农药大白菜
- 基于同源建模与分子对接技术构建抗Bt Cry1类毒素单链抗体定点饱和突变库被引量：4
- 2016年
- 转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本研究利用基因工程抗体易于定向修饰及Cry毒素具有相似结构的特点,以实验室前期获得的人源化抗苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry1Ac毒素单链抗体为材料,通过同源建模模拟单链抗体及五种Cry1类毒素的三维结构并利用分子对接技术分析单链抗体与Cry1类毒素结合的关键氨基酸位点;在此基础上利用重叠延伸PCR技术对关键氨基酸位点及其邻近位点进行定向改造,以构建定点饱和突变库,为筛选检测多种Cry1类毒素的广谱特异性抗体提供实验材料。
- 焦凌霞徐茜茜刘媛张霄刘贝贝梁颖刘贤金
- 关键词：单链抗体同源建模分子对接重叠延伸PCR
- 基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用被引量：5
- 2016年
- 从天然抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低,在微摩尔水平;同时,经过多次免疫获得的天然抗体也存在100 pmol/L的亲和力极限。然而,以抗体亲和力体内成熟为理论基础的亲和力体外成熟技术,可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程。该技术可以解决库来源抗体亲和力不高、实际应用难的问题,也可以帮助天然抗体突破其亲和力极限。抗体基因体外突变技术可以模拟自体高频突变过程,是抗体亲和力体外成熟的重要手段,常见的抗体基因体外突变技术可以分为易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、DNA改组、突变株、定点突变和链替换等方法。易错PCR可以在抗体基因全长或部分区域随机引入突变,但随着突变率的增加,阳性克隆数量呈指数性递减。DNA改组包括抗体片段随机化切割和重组步骤,可以加快抗体的体外进化速度。突变株法易于构建超大容量的抗体库,但有害突变和突变率难以控制。定点突变的区域通常选择与抗原直接接触的互补决定区(complementary determination region,CDR)或自体突变热点进行操作。链替换通常保留母体抗体的一条重链或轻链,而对另一条链进行随机化组合。这些基因突变方法在提高抗体亲和力中获得了不同程度的应用,但也存在效率不高,且方法选择较为盲目等问题。可是,采用抗体X射线晶体衍射和计算机模拟等方法,却可以帮助预测抗体结合部位,为突变位点的理性设计和方法选择提供有效信息,因而成为亲和力体外成熟技术未来发展的趋势之一。
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- 关键词：抗体易错PCRDNA改组突变株定点突变
- 玉米赤霉醇特异性单克隆抗体及其胶体金检测试纸的研制被引量：5
- 2015年
- 为了研究国内制备的玉米赤霉醇单克隆抗体,与其同系物玉米赤霉烯酮交叉反应严重,实际检测存在假阳性的问题,本试验开展了玉米赤霉醇特异性识别单克隆抗体及其胶体金检测试纸的研制工作。试验采用玉米赤霉醇-16-羧丙基醚与牛血清白蛋白偶联,免疫雌性Balb/c系小鼠;利用单克隆抗体技术完成杂交瘤融合,并用非竞争及竞争ELISA法,对阳性克隆进行鉴定。杂交瘤诱生腹水后,经亲和纯化,用于15 nm胶体金标记,制作玉米赤霉醇胶体金检测试纸。融合细胞经筛选,最终对3株杂交瘤细胞建株,结果均为Ig G1型。其中Mab-1A8诱生腹水效价高达1∶1.28×10^7,对玉米赤霉醇抑制中浓度（I50）为10.25 ng·m L^-1,检测灵敏度（I10）为1.96 ng·m L^-1,线性检测范围在2.96-35.46 ng·m L^-1,对同系物玉米赤霉烯酮的交叉反应率小于0.1%。试验研制的玉米赤霉醇胶体金试纸,检测阈值为2.5μg·m L-1,检测时间为10 min。本研究制备了一种新型玉米赤霉醇特异性单克隆抗体,并研制了以单抗为基础的玉米赤霉醇胶体金快速检测试纸,为玉米赤霉醇残留快速检测提供了灵敏、便捷的新方法。
- 刘媛文孟棠张霄徐重新杨晶祎张留娟王恒何鑫梁颖郑勤夏兴霞刘贤金
- 关键词：玉米赤霉醇单克隆抗体玉米赤霉烯酮
