国家重点基础研究发展计划(2007CB512204)
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
- 相关作者：孙兴怀凌志红郭文毅吴继红方媛更多>>
- 相关机构：复旦大学复旦大学上海医学院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 视网膜神经胶质细胞与青光眼被引量：1
- 2010年
- 青光眼视神经病变以进行性的视网膜神经节细胞丧失和相应的视功能损害为特征。导致青光眼视神经病变的病理生理机制尚不明确。在中枢神经系统，神经胶质细胞参与了神经元在受到机械、缺血、缺氧等损伤后的病理变化过程。胶质细胞参与青光眼视神经病变的机制复杂多样，但部分机制与中枢神经系统相似。本文就视网膜神经胶质细胞的生理功能、动物青光眼模型建立后胶质细胞的反应以及针对胶质细胞的青光眼视神经保护治疗手段做一综述。
- 武娜吴继红孙兴怀
- 关键词：青光眼高眼压胶质细胞标记物
- 脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白融合基因载体的构建、鉴定及初步应用研究
- 2009年
- 目的构建脑源性神经营养因子（BDNF）绿色荧光蛋白（GFP）融合表达质粒，观察其融合蛋白的特性。方法将BDNFcDNA片段插入pcDNA3．1／NT-GFP—TOPO真核表达质粒，使其与GFP同处一个阅读框架中，测序鉴定后，转染培养的雪旺细胞，用免疫组织化学和蛋白质印迹（Western botting）观察外源性目的蛋白的表达情况，并用该质粒活体转染视神经切断的大鼠模型，观察所表达外源性蛋白的神经保护作用。结果测序证实质粒构建成功。Westernbotting结果显示，BDNF—GFP融合蛋白表达一相对分子质量为41×10^3。大小条带。荧光显微镜下可见BDNF～GFP转染的细胞发出绿色荧光，免疫组织化学染色后，可见绿色荧光与红色荧光完全重合。转染BDNF—GFP质粒和GFP质粒的大鼠视神经切断术后7d存活视网膜神经节细胞（RGC）分别为（1201±286）、（482±151）个／mm^2，存活百分比分别为（51．39±12．24）％和（20．62±6．46）％；28d时存活的RGC分别为（715±71）、（112±24）个／mm^2，存活百分比分别为（30．59±3．04）％和（4．79±1．03）％。两组存活百分比比较，差异有统计学意义（t=3．144，11．378；P〈0．01）。结论BDNF-GFP融合表达载体可以转录翻译为一融合蛋白，该蛋白可自发绿色荧光，并具有BDNF的生物学活性。
- 方媛樊嘉雯莫晓芬孙兴怀郭文毅孔德升马端田洁
- 关键词：基因疗法动物实验
- 构建睫状神经营养因子绿色荧光蛋白融合表达载体电穿孔转染雪旺细胞的研究被引量：2
- 2009年
- 目的构建睫状神经营养因子-绿色荧光蛋白（CNTF-GFP）融合表达质粒，以电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞，为优化细胞移植、促进视神经再生提供效果更好且便于观察的方法。方法实验研究。构建重组质粒pcDNA3．1／CNTF-GFP；经测序鉴定后，电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞；荧光显微镜下动态观察转染效果，流式细胞计数；转染24h后，用RT—PCR及免疫组化法检测基因转染及蛋白表达情况。结果重组质粒经测序鉴定无误；在3h即可见部分荧光，12h逐渐增多，24—72h到达高峰，持续至7d仍有表达；流式细胞计数得转染率为44．93％±12．92％，转染24h后，RT-PCR示目的基因有较高转录，免疫组化示有CNTF蛋白的高表达，并与GFP蛋白表达部位完全重合。结论成功构建了CNTF-GFP融合表达质粒；电穿孔法转染雪旺细胞后，表达良好，为制备转基因的种子细胞从而促进视神经再生的研究奠定了基础。
- 方媛莫晓芬孙兴怀郭文毅田洁孔德升马端张萌
- 关键词：睫状神经营养因子绿色荧光蛋白质类电穿孔
- 慢性高眼压大鼠视网膜胶质细胞TNF-α及其受体的表达被引量：2
- 2008年
- 目的:通过研究大鼠慢性高眼压模型视网膜胶质细胞TNF-α及其受体的表达,探索胶质细胞在青光眼视网膜神经节细胞损伤中的作用机制。方法:用结扎上巩膜静脉联合术后球结膜下注射5-Fu的方法建立大鼠慢性高眼压模型。在模型建立后1月,做眼球冰冻切片,行免疫组织化学染色,在激光共聚焦显微镜下观察视网膜TNF-α-GFAP、TNF-α-OX42、TNFR-1-GFAP以及TNFR-1-NeuN的双标染色情况。结果:结扎上巩膜静脉联合术后结膜下注射5-Fu可诱导较长时间稳定高眼压,4周内6只高眼压眼眼压均大于22mmHg;正常大鼠视网膜未见明显TNF-α以及TNF-R1阳性染色,1个月高眼压大鼠TNF-α在视网膜的表达高于正常对照组,并且有TNF-α-GFAP、TNF-α-OX42的共表达;在慢性高眼压情况下,TNF-R1在视网膜内层的表达也高于正常对照组,并且在视网膜内层有TNF-R1与GFAP的共表达,但TNF-R1与神经节细胞层NeuN(神经元特异性核蛋白)没有共表达。结论:在慢性高眼压情况中,活化的视网膜胶质细胞来源的TNF-α可能在神经节细胞损伤中发挥重要作用。
- 凌志红孙兴怀
- 关键词：高眼压肿瘤坏死因子受体肿瘤坏死因子
- 慢性高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞组织病理学改变被引量：5
- 2008年
- 目的 研究青光眼视网膜神经胶质细胞组织病理学改变及其在青光眼视网膜神经节细胞损伤中的作用机制。方法 对照实验研究。选用造模成功的慢性高眼压雄性SD大鼠72只，眼压〉22mmHg（1mmHg=0．133kPa）。右眼为慢性高眼压眼，左眼为假手术对照眼。根据慢性高眼压模型建立的时间（手术结束时开始计算），将实验鼠分为6组（2、12h，1d，1、4、8周），每组12只鼠。正常组SD大鼠12只，平均眼压12．56mmHg。分别取实验各组（慢性高眼压）、假手术组及正常组大鼠4只眼球，冰冻切片行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色，在激光共焦显微镜下观察视网膜星形胶质细胞及Mtiller细胞的GFAP表达情况；分别取实验各组（慢性高眼压）和正常组大鼠4只眼球，在视网膜铺片上进行GFAP免疫组织化学染色，进行星形胶质细胞计数并观察其形态；分别取实验各组（慢性高眼压）、假手术组及正常大鼠4只眼球的鼻侧半视网膜，在视网膜铺片上行小胶质细胞标记物OX42免疫组织化学染色，进行小胶质细胞计数并观察其形态；取剩余的颞侧中周部视网膜，半薄切片行甲苯胺蓝染色并进行Miiller细胞计数。对不同时间点慢性高眼压组与正常组大鼠细胞表达数量进行比较，采用单因素多水平设计定量资料的方差分析。结果 慢性高眼压模型建立后2h，即有活化的小胶质细胞出现；1d后小胶质细胞的数量开始增加，为（327．40±68．32）个／mm^2；1周后小胶质细胞的数量达到高峰，为（965．06±86．63）个／mm2，与正常组小胶质细胞数量比较，差异有统计学意义（F=196．56，P〈0．01）；其后小胶质细胞数量逐渐减少。慢性高眼压模型建立后12h，星形胶质细胞及Miiller细胞开始呈现活化状态；4周时两种细胞的活化程度达到高峰，以后活化程度逐渐下降，且活化的星形胶质�
- 凌志红孙兴怀
- 关键词：高眼压视网膜神经胶质视网膜神经节细胞
- 成人视乳头星形胶质细胞的纯化培养及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的探讨稳定的成人视乳头星形胶质细胞原代纯化培养方法及其理想细胞模型。方法实验研究。解剖显微镜下分离出人眼视乳头筛板组织，将其剪切成4—6个小组织块，放置于含有DMEM／F12培养基的培养皿中培养。8～10周后去除组织块，以0．25％胰蛋白酶消化细胞，改用星形胶质细胞选择性培养基，经两次传代后，通过细胞形态学和胶质细胞原纤维酸性蛋白、神经细胞黏附分子免疫荧光染色，观察纯化培养的星形胶质细胞生长情况并进行细胞鉴定。结果组织块接种2～3周后，有细胞相继从其边缘爬出，迅速向周围分裂生长，其移行过程明显。胰酶消化后细胞的形态多呈扁平星形或多角形，也可见长梭形细胞。改用星形胶质细胞选择性培养基培养并传代后，细胞几乎均呈扁平星形，并表达胶质细胞原纤维酸性蛋白和神经细胞黏附分子。结论精确分离筛板组织并将小组织块定位于培养液边缘（培养液并未完全覆盖皿底），有利于组织块贴壁生长，是获取人原代星形胶质细胞的前提条件；星形胶质细胞选择性培养基是获得原代纯化星形胶质细胞的简便有效方法。
- 武娜徐建江张圣海杨伯齐乐琦华吴继红孙兴怀
- 关键词：视盘星形细胞细胞培养技术青光眼
