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猪附红细胞体ORF4基因片段的人工合成及基因表达: 2011年; 目的本研究通过人工合成猪附红细胞体ORF4基因,使其在大肠杆菌中高效表达。方法选择GenBank注册的AJ504999序列的ORF4基因,应用Graphical Codon Usage Analyser选择大肠杆菌偏爱的密码子,改变基因的transl_table,设计并合成3对寡核苷酸链,用PCR-based accurate synthesis（PAS）法进行人工合成。经测序正确后,连接到表达载体PET28a,获得重组表达质粒PET28a/ORF4,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在30℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,在11 kDa附近出现目的片段。结果结果表明ORF4基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,通过生物信息学软件分析表明,该蛋白存在19个配基结合位点;在21~22位氨基酸可能存在信号肽裂解位点;为胞内蛋白,没有糖基化位点。结论 ORF4基因能够在大肠杆菌中表达,推测其在M.suis蛋白质的形成,M.suis的生物功能方面有着重要的作用。; 周栋陈甜甜刘建柱成子强张利刘海涛张璐刘永夏柴同杰; 关键词：猪附红细胞体

猪附红细胞体MSG1基因人工合成、克隆、表达及免疫原性分析被引量：2: 2011年; 目的利用引物重叠扩增法人工合成猪附红细胞体粘附蛋白基因MSG1,并检测其免疫原性。方法将人工合成的猪附红细胞体粘附蛋白基因MSG1产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28c,构建pET28c_msg1表达载体,转入E.coli BL21,IPTG诱导表达。用SDS-PAGE,Western-blot方法分析鉴定,表达产物具有很好的抗原性。纯化后的重组蛋白接种昆明小白鼠后,用重组蛋白作为抗原包被酶标板,以检测接种昆明小白鼠血清抗体的产生。结果结果表明MSG1基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,并能够刺激小鼠产生较好的抗体。结论人工成功的合成了猪附红细胞体粘附蛋白基因MSG1,其基因可在大肠杆菌中高效表达,并可刺激小鼠产生较好的抗体。; 陈甜甜刘建柱成子强张利周栋王振勇刘海涛刘永夏王淑静柴同杰; 关键词：猪附红细胞体 ELISA

应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA检测方法的建立被引量：3: 2011年; 【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白(rMSG1)和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25%,其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用,并且与其它一些抗原无交叉反应;此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%,较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率。【结论】结果显示MSG1具有良好的抗原性,建立的ELISA方法具有较高的敏感性、特异性、符合性和可重复性,在临床检测中可以取得理想的效果。; 刘永夏刘建柱成子强周栋王振勇刘海涛王林柴同杰; 关键词：猪附红细胞体 ELISA

猪附红细胞体ORF2的全基因合成、表达与鉴定被引量：2: 2011年; 通过重叠区扩增法(PCR-based accurate synthesis,PAS)人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌(DE3)中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。; 周栋成子强刘建柱张利刘海涛刘永夏周川柴同杰; 关键词：猪附红细胞体 ORF2

猪附红细胞体重组MSG1蛋白ELISA检测方法的建立: 【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白(rMSG1)和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测方法。【方法】将M...; 刘永夏刘建柱成子强周栋王振勇刘海涛王林柴同杰; 关键词：猪附红细胞体 ELISA; 文献传递

猪附红细胞体MSG1部分基因片段的全基因合成及克隆表达被引量：1: 2010年; 通过人工合成猪附红细胞体MSG1基因的编码序列,以提高目的基因在大肠杆菌中的高效表达。根据Gen-Bank注册的AM407404的544～942氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了12条寡核苷酸片段。用重叠区扩增法(PAS)全基因合成MSG1部分目的基因,克隆入pjet1.2/blunt载体。经测序证实正确后,构建原核表达载体pET-28c/MSG1,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得含重组表达质粒的转化子,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。测序、酶切鉴定等结果表明,表达载体构建成功,诱导表达后大约在16000的位置出现明显的蛋白条带。; 陈甜甜刘建柱周栋刘海涛成子强郭慧君王振勇张利柴同杰; 关键词：猪附红细胞体

猪附红细胞体抗原特性分析被引量：2: 2010年; 从自然感染的猪血液中纯化猪附红细胞体,应用SDS-PAGE和免疫印迹试验对猪附红细胞体抗原蛋白组分进行了初步分析.通过SDS-PAGE分离得到13种蛋白质,其蛋白分子量范围为24～170 kD,分别是120、112、110、108、68.2、58、49.6、41.2、30、29、26.2、25和24.3 kD.应用免疫印迹试验筛选出了6种特异性蛋白质,分子量分别是108、98.2、68.2、41.2、35和31 kD.; 刘海涛刘建柱成子强张利周栋刘永夏周川柴同杰; 关键词：猪附红细胞体抗原特性分析免疫印迹试验蛋白组分猪血液

猪嗜血支原体ORF9的全基因合成及原核表达被引量：1: 2011年; 为原核表达猪嗜血支原体(M.haemosuis)ORF9蛋白,本研究根据GenBank登录的AJ504999的ORF9基因序列,采用重叠延伸PCR技术(SOE-PCR),选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成4对寡核苷酸片段,人工合成ORF9基因。将其克隆于表达载体pET-32a中构建重组表达质粒pET-ORF9,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和western blot鉴定表明,重组蛋白的分子量约为34 ku。; 周栋刘建柱张璐成子强牛绪东刘海涛刘永夏杨笃宝王淑静; 关键词：原核表达

猪附红细胞体ORF5的全基因合成、表达与鉴定1: 目的通过重叠区扩增法(PCR-based accurate synthesis,PAS),人工合成猪附红细胞体ORF5基因,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。方法根据GenBank注册的AJ504999的OR...; 周栋刘建柱张璐成子强张利刘海涛刘永夏杨笃宝王淑静; 关键词：猪附红细胞体 ORF5; 文献传递

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山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2009NY007)