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转化生长因子β_1联合血管内皮细胞生长因子体外诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化被引量：4: 2007年; 目的:观察胚胎干细胞在转化生长因子β1和血管内皮细胞生长因子体外诱导分化血管内皮细胞的能力,探讨提高诱导效率的方法。方法:实验于2004/2006在南昌大学医学院第二附属医院血液病研究所进行。实验材料:成年昆明小鼠由南昌大学医学院动物科学部提供(机构许可证号:96021),经自然交配怀孕。小鼠胚胎干细胞129×1/SvJ细胞系,购于ATCC公司。实验方法:取孕12.5～14.5d的胎鼠,制作小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增胚胎干细胞。将饲养层上扩增后生长状态好的胚胎干细胞以0.25%胰酶消化,小心吹打成单个细胞悬液,以差速贴壁法将饲养层细胞去掉,按1×104L-1胚胎干细胞悬液悬滴在细胞培养皿的盖上,每滴10～20μL,不换液,3d后形成拟胚体,培养液为不含白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液。挑选状态好的拟胚体分3组:转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组、转化生长因子β1+血管内皮细胞生长因子诱导组。采用RT-PCR和免疫组织化学方法证实诱导的细胞是否为内皮细胞。结果:①胚胎干细胞体外诱导生长观察:3组中拟胚体贴壁后第2天,胚体均略摊开,周围有上皮样细胞出现,第3,4天有许多卵石样细胞产生,至第6天开始出现由卵石样细胞构成的管状结构,自胚体向周围呈辐射状生长,渐呈网状,诱导时间约2周。转化生长因子β1+血管内皮细胞生长因子诱导组中产生的管样结构的拟胚体数较转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组多(44.67±3.88,28.17±6.08,33.00±2.68,P<0.05)。②RT-PCR法检测基因mRNA水平:3组基因表达的扩增片断分别为1086,733,265bp,与DNAmark相比较,条带位置相符。③扩增细胞的免疫组织化学染色:Ⅷ因子抗体反应显示阳性。结论:转化生长因子β1与血管内皮细胞生长因子均能诱导胚胎干细胞为内皮细胞; 熊吉信刘小春杨春江刘兆轩; 关键词：胚胎干细胞转化生长因子Β1 血管内皮细胞生长因子内皮细胞

小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化被引量：2: 2008年; 目的：血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品,但来源有限。胚胎干细胞具有发育全能性,目前其定向诱导机制尚不明确。通过选择适当的诱导剂,探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势。方法：实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成。①动物及细胞系：清洁级孕12.5d昆明小白鼠1只,由南昌大学医学院动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018,由American Type Culture Collection提供。②实验方法：取孕12.5d鼠胚胎,去除头部、内脏及四肢,将组织块剪碎,胰酶消化,分离培养胚胎成纤维细胞,传至3～5代时更换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基,24h后收集培养液,加入2.0mmol/LL-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸,0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,1000U/mL白血病抑制因子,此即为条件培养基。常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ,以1×10^6密度接种,传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞,加入条件培养基5mL,经过悬滴-悬浮培养,构建拟胚体分化模型。设立3组,各组均置于明胶包被的T25培养瓶中,每瓶加入50个拟胚体,使其均匀分布于培养瓶底。诱导组7～10d加入10^-9mol/L全反式维甲酸和3μg/L转化生长因子β1,10～21d加入20μg/L血小板源性生长因子。血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清,全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸。诱导21d的拟胚体,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞,再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7d。③实验评估：应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达。通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质。结果：①胚胎干细胞生长及拟胚体诱导分化：胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚�; 刘兆轩熊吉信杨春江刘小春戴育成; 关键词：胚胎干细胞拟胚体血管平滑肌细胞血小板源性生长因子

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化: 目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞向内皮细胞的条件,为血管组织工程提供种子细胞。方法体外培养小鼠胚胎干细胞形成拟胚体诱导胚胎干细胞,以3ng/ml转化生长因子β1(TGF-β1)+50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF...; 熊吉信刘小春刘兆轩杨春江; 关键词：胚胎干细胞内皮细胞血管组织工程; 文献传递

鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管平滑肌细胞的实验研究: 目的探讨体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化的条件,为血管组织工程提供种子细胞。方法用条件培养基体外培养小鼠胚胎干细胞增殖,构建拟胚体分化模型,用10-9mol/L维甲酸、3ng/ml转化生长因子β1以及20n...; 熊吉信刘兆轩刘小春杨春江; 关键词：胚胎干细胞血管平滑肌细胞血小板源性生长因子BB; 文献传递

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的研究被引量：9: 2007年; 目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞（embryonic stemcell，ESC）向内皮细胞分化的条件，为组织工程血管提供种子细胞。方法取怀孕12．5d的昆明小白鼠1只，断颈处死，取其胚胎，培养制备小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）。常规复苏ESC后进行体外培养，采用悬滴-悬浮法制备拟胚体（embryoid body，EB）。将EB分两组：实验组加入含有3ng／ml转化生长因子β1、50ng／ml血管内皮细胞生长因子及1μmol／L激活素受体样激酶选择性抑制剂的EB培养基；对照组只加入EB培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况。采用RT—PCR及免疫组织化学染色检测诱导细胞vWF和CD34的表达，验证细胞性质。结果原代MEF生长迅速，第3天细胞融合达90％左右，细胞呈长梭形，有少量侧支，细胞核饱满，有2～3个核仁，细胞排列紧密。传至3～5代，细胞呈多角形，胞浆饱满，有3～4个核仁，细胞表面分泌较多细胞颗粒。ESC在饲养层上保持未分化状态，细胞团形态呈鸟巢样，边缘平整，单个细胞体积小，折光性强，核质比高，增长速度快。悬滴培养3d的EB肉眼可见，再经悬浮培养3d后，形成较大的透亮EB；EB贴壁后第2天，球体略摊开。实验组第4～7天，EB周围有许多圆形细胞产生，第10b14天，可见由大量圆形细胞组成的血管样结构自EB周围生长；对照组EB周围未见血管样结构生长。免疫组织化学染色见EB周围大量vWF染色阳性细胞，RT—PCR检测到vWF和CD34的表达。结论ESC在特定的条件下可以分化为内皮细胞，有可能为组织工程血管提供大量的种子细胞。; 熊吉信刘兆轩刘小春杨春江; 关键词：胚胎干细胞内皮细胞组织工程血管

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良被引量：2: 2008年; 背景:如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。目的:改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。设计、时间及地点:以细胞为培养对象,观察性实验,于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。材料:新西兰家兔,体质量2kg左右,用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。方法:以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。主要观察指标:免疫细胞化学法对两者进行鉴定;流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。结果:培养的种子细胞符合各自特征,免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。结论:胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞;第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。; 唐新华黄玲夏宁彭兆意熊吉信; 关键词：血管组织工程

血管组织工程中的胚胎干细胞被引量：2: 2006年; 血管组织工程学是新近兴起的一门学科,其目的是经过胚胎干细胞的体外培养形成血管。其中,种子细胞来源是关键,胚胎干细胞由于不存在异种排斥问题,是理想的选择。现在许多学者进行了由胚胎干细胞向血管内皮细胞的转化研究,取得了初步的进展,这些研究解决了许多理论和实践上的问题,促进了血管组织工程的发展。; 刘小春熊吉信; 关键词：血管组织工程胚胎干细胞血管内皮细胞血管

胚胎干细胞构建小口径组织工程血管的研究: 2008年; 目的通过小鼠胚胎干细胞定向分化出的内皮细胞和平滑肌细胞构建组织工程小口径血管。方法将小鼠胚胎干细胞诱导分化出的内皮细胞和平滑肌细胞分别种植于管状聚乳酸-羟基乙酸(polylactic glycolic acid,PL-GA)管腔内面,构建出小口径组织工程血管,再将其移植入裸鼠皮下,每隔1周取1次包埋的小口径组织工程血管,共取3次;再行HE染色,免疫组化行内皮细胞、平滑肌细胞鉴定,并且在倒置相差显微镜下观察其形态。结果倒置相差显微镜下观察结果显示小鼠胚胎干细胞诱导分化出的平滑肌细胞呈长梭形,而内皮细胞呈"鹅卵石"样;HE染色显示平滑肌、内皮细胞在PLGA表面上延伸生长;动物体内移植实验结果显示,管状PLGA皮下小口径组织工程血管移植后逐渐降解、直至变薄中断,免疫组织化学和HE染色显示管腔内的血管平滑肌样细胞和内皮样细胞在PLGA上呈片状融合生长,并见大量的细胞外基质。结论胚胎干细胞诱导的平滑肌和内皮细胞与PLGA有良好亲和性,可以用胚胎干细胞与PLGA制作小口径组织工程血管。; 夏宁黄玲彭兆意刘新华熊吉信; 关键词：生物相容性胚胎干细胞组织工程材料裸鼠

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国家自然科学基金(30360102)

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