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产甘油假丝酵母细胞回用对甘油生产的影响被引量：3: 2007年; 研究了产甘油假丝酵母细胞回用生产甘油的反复分批发酵。实验结果表明：第一级发酵培养基KH2PO4浓度为0．4g·L^-1，回用培养基的最适KH2PO4浓度为0．1g·L^-1，当上一批次发酵液中葡萄糖浓度降至10g·L^-1以下时，酵母细胞不经洗涤即可回用；经过15个批次的反复分批发酵过程，甘油的平均产量、平均得率和平均生产能力分别达到138．69g·L^-1、60．17％和2．31g·L^-1·h^-1，分别比第一级发酵结果增加了15．74％、15．48％和39．16％；但回用至第15次时，菌体出现严重衰退，因此回用周期以12～14次为宜。; 谢涛方慧英饶志明诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母甘油

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究被引量：3: 2007年; 考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。; 饶志明艾丽静沈微方慧英诸葛健; 关键词：谷胱甘肽摇瓶发酵罐

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子被引量：7: 2008年; 【目的】克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性。【方法】采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp。将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp。通过电击转化酿酒酵母W303-1A。将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测。【结果】重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强。【结论】PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义。; 丁春生饶志明诸葛斌沈微陈献忠方慧英诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母

优化简并引物PCR克隆Candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段: 2008年; 为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD+-3-磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD),对不同酵母和其他真核生物的NAD+-3-磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.glycerinogenes的NAD+-3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段,经过优化PCR反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPD基因中约600 bp的保守核心片段。DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD+-3-磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPD基因相似性较高。; 陈献忠饶志明沈微诸葛斌方慧英王正祥诸葛健; 关键词：PCR 产甘油假丝酵母克隆

产甘油假丝酵母基因CgZWF片段的克隆与序列分析: 2007年; 以产甘油假丝酵母基因组DNA为模板,通过简并PCR和反向PCR扩增得到了一个长为1 244 bp片段,并将其克隆到pMD18-Tvector。基因序列分析表明,此片段编码的氨基酸序列与Kluyveromyces lactis的G6pdp同源性最高(62.7%),表明已经得到编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的目的基因片段。该研究为阐明磷酸戊糖途径在产甘油假丝酵母耐高渗和甘油高产中的作用奠定了基础。; 张永光饶志明沈微方慧英诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母葡萄糖克隆

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除被引量：8: 2007年; 以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)标准菌株ATCC13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom),在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km),得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g-hom::Km-8发酵60h赖氨酸产量达到4.7g/L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032(0.7g/L)的6.7倍。; 饶志明张君胜沈微方慧英诸葛健; 关键词：赖氨酸谷氨酸棒杆菌

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶编码基因的克隆被引量：4: 2008年; 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)作为优良的甘油生产菌株已经成功应用于工业化生产。但相对于酿酒酵母,该菌株的耐高渗机理和甘油代谢的分子机制还不甚清楚。本文根据已公布的3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列信息,设计出一组寡核苷酸,再运用简并PCR结合反向PCR技术从C.glycerinogenes的基因组DNA中获得了4900 bp的核苷酸序列,递交GenBank(No.EU186536)。该序列包含完整的编码胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)开放阅读框及其上、下游调控序列。1167bp的开放阅读框编码388个氨基酸残基的蛋白。所演绎出氨基酸序列分析比对结果表明该基因产物的序列具有典型的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶结构特征,但与已鉴定的相关基因存在中等程度的同源性并在相应的辅酶催化位点和底物结合位点区域具有高度的保守性,在氨基酸水平上与安格斯毕赤酵母的相似性最高,达到70.9%。该基因在Saccharomy cescerevisiae W303A中异源表达能够显著提高细胞的甘油合成能力。; 陈献忠方慧英沈微饶志明诸葛斌王正祥诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母 3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆甘油合成

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析: 2008年; 从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子。插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%。多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区。对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因。; 姚雁沈微饶志明王正祥诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母烯醇化酶

REMI介导电转化产甘油假丝酵母被引量：1: 2007年; 为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择HindIII进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD600≈1.3时收集细胞,在1.5kV电压下,感受态细胞浓度为2.0×109个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μgDNA的较高转化率,58%的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。; 张永光沈微饶志明方慧英诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母

以Zeocin抗性基因为选择标记的Candida glycerinogenes遗传转化被引量：3: 2008年; 为从分子水平上阐释产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高产甘油机理,建立一种方便可行的遗传转化系统是十分必要的。与G418和潮霉素等抗生素相比,Zeocin抗生素对C.glycerinogenes具有较低的致死浓度。以pGAPZb作为构建整合载体的骨架,以Zeocin抗性基因作为选择标记,以URA3基因作为整合位点,构建了C.glycerinogenes整合载体pGA-CU。整合载体经过限制酶线性化后用作转化载体,基于电击转化的方法成功获得了抗Zeocin的转化子并经过PCR分析进一步确证。通过优化电击转化的参数,获得了较为稳定的转化效率,基于这一技术的转化效率每微克DNA可获得120个转化子。为进一步研究该菌株的遗传背景和代谢机理奠定了基础。; 陈献忠饶志明沈微方慧英王正祥诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母遗传转化系统电击转化

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