国家自然科学基金(31372561)
- 作品数：3 被引量：10H指数：2
- 相关作者：吕利群张娅楠李炎刘海云宗乾坤更多>>
- 相关机构：上海海洋大学中国水产科学研究院黄海水产研究所更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 免疫刺激诱导草鱼肿瘤坏死因子TNF-α的体外表达特征研究被引量：3
- 2016年
- 为了阐明免疫刺激诱导草鱼肿瘤坏死因子TNF-α的体外表达特征,克隆了草鱼TNF-α的c DNA,构建了原核表达载体p ET-32-TNF-α,并在大肠杆菌DH5α中表达了His6-TNF-α。利用亲和层析镍柱纯化表达重组蛋白后将其作为免疫原免疫小鼠制备了抗草鱼TNF-α多克隆抗体。免疫印迹实验显示,制备的抗体能特异性识别细胞内源性TNF-α。在此基础上,分别研究了GCRV(草鱼呼肠孤病毒)感染、免疫刺激物Poly(I:C)及LPS处理下不同时间点草鱼肾细胞CIK中TNF-α的表达情况,结果表明,TNF-α在草鱼肾细胞内翻译水平的表达量基本保持稳定。研究显示经典的TNF信号通路激活因子不能引起CIK细胞内TNF-α蛋白水平的显著变化。
- 卢翠玉李炎刘庆慧吕利群
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体
- 草鱼肾细胞电转条件的优化及草鱼呼肠孤病毒NS26蛋白的瞬时表达被引量：2
- 2014年
- 本研究先以pEGFP-N1载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验,优化电压、脉冲时间、质粒添加量和电击次数等电转条件,确立最佳条件。实验表明,细胞密度为1.5×107/mL时,取200μl在0.2cm电击杯中进行电击转染,电压为200V,脉冲时间为45ms,添加质粒30μg,电击1次时,转染效果最佳。提取草鱼呼肠孤病毒基因组总RNA,以其逆转录的cDNA作为扩增模板,设计特异引物扩增出GCRV非结构蛋白NS26的基因片段,重组到pEGFP-N1载体上得到重组质粒pEGFP-NS26,将其导入CIK细胞中用电转法高效表达了EGFPNS26融合蛋白。本研究为进一步研究NS26的功能奠定了基础。
- 李炎张娅楠吕利群
- 关键词：电转染草鱼呼肠孤病毒重组质粒
- 草鱼呼肠孤病毒GCRV VP56相互作用蛋白的鉴定被引量：5
- 2016年
- 为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A(Gc JAM-A)基因,并构建p GADT7-Gc JAM-A载体,在酵母中研究草鱼Gc JAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒p GBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与Gc JAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。
- 喻飞王浩宗乾坤张娅楠刘海云陈百朋吕利群
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒酵母双杂交
