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嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达被引量：4: 2008年; BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。; 柯涛熊兰石晴芳马向东; 关键词：基因合成酶学性质

一种用于高效筛选极端酶突变基因的质粒营救法被引量：1: 2009年; 为简化定向进化筛选突变耐高温和耐酸碱酶等极端酶的繁复工作，建立了一种快速质粒营救法，可直接从加热处理的平板中回收携带有突变基因的质粒，用于进一步的随机突变基因的筛选和基因测序等。研究了在不同的热处理条件下的质粒营救效率，获得了质粒营救转化效率最高的处理条件。结果表明，本方法适于质粒大小在2-10kb范围的载体，可用于平板筛选最适酶活性温度在60-100℃、pH4-10的突变体酶，并可将一轮的筛选过程缩短1-2d。; 柯涛胡凡石晴芳马向东; 关键词：定向进化极端酶

短小芽孢杆菌热稳定环糊精葡萄糖基转移酶粗酶酶学特性研究: 2008年; 从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase)产生菌CGT01。16SrDNA序列分析表明该菌与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的同源性为99%。同时根据其生理生化特征,该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus)。命名为B.pumilus.CGT01菌株。产生CGTase的最适初始pH为6.5,最适培养温度为37℃。菌株所产CGTase的最适pH值和最适反应温度分别为pH6.5和60℃,并有较高的热稳定性。60℃条件下保温,酶活基本稳定,半衰期为35 min。酶液中添加1 mmol/L Ca2+能明显提高CGTase的稳定性,60℃保温1 h后,剩余酶活仍达80%以上。SDS-PAGE检测表明酶的分子量约为78 ku左右。经高效液相色谱分析表明,CGTase作用于可溶性淀粉后的主要产物为葡萄糖、麦芽糖和β-环糊精,没有检出α和γ型环糊精产物,因此所产环糊精为单一类型,不同于同种属的其他菌株所产CG-Tase。; 柯涛王庆林惠丰立熊兰马向东马立新; 关键词：短小芽孢杆菌 Β-环糊精环糊精葡萄糖基转移酶酶学特性

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河南省教育厅自然科学基金(2008B80010)