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H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析被引量：3: 2008年; 【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1(nonstructural protein1)基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒(H9N2)的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应;ELISA检测显示,在被检血清稀释1280倍时,阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍,差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高,易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。; 王方昆袁秀芳王一成张存徐丽华刘思当; 关键词：猪流感病毒 NS1基因反应原性

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APX Ⅱ基因特异片段的克隆和表达被引量：3: 2007年; 将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APXⅡ的一段毒素基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET-APXⅡ,并将其转化到受体菌BL21中,诱导剂IPTG进行诱导表达,4 h后达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白大小约为31 kD。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,说明该表达蛋白具有免疫原性,这为下一步用此表达蛋白作为抗原,对APP进行诊断试剂的研制和基因工程疫苗的研究提供科学依据。; 袁秀芳王一成徐丽华张存叶伟成; 关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌克隆

重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立被引量：1: 2008年; 用纯化的H9N2亚型猪流感可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流感抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为12.5μg/mL,37℃1 h,4℃过夜;血清稀释度为1∶40;酶标SPA稀释度为1∶10 000,37℃温育40 min,底物显色37℃15 min。经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验,结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用TG-ROC软件确定了自制ELISA(NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83%和91.43%。与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94.00%,无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40%。; 王方昆袁秀芳刘思当张存徐丽华王一成; 关键词：猪流感 ELISA

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ表达蛋白单克隆抗体的制备: 将APP apxⅣN端基因克隆于pET-28a载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。收获融合表达的apxⅣ蛋白,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/C小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓...; 袁秀芳王一成徐丽华; 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌单克隆抗体; 文献传递

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达被引量：16: 2007年; 以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。; 王方昆王一成袁秀芳徐丽华; 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌克隆

猪胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ表达蛋白单克隆抗体的制备被引量：1: 2008年; 将APP apx Ⅳ N端基因克隆于pET-28a载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。收获融合表达的apx Ⅳ蛋白,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/C小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用apxⅣ表达蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得了3株能稳定分泌抗apx Ⅳ蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为4H3,1D11和4C1。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG1型。经Western blot分析证实,3株杂交瘤细胞上清液能与apxⅣ表达蛋白特异反应。本研究获得的融合蛋白单克隆抗体为今后建立该菌的免疫胶体金诊断技术,分析apxⅣ蛋白的抗原表位等提供有益价值。; 袁秀芳徐丽华王一成张存叶伟成; 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌单克隆抗体

H9N2亚型猪流感病毒NP基因的原核可溶表达及单克隆抗体的制备: 参照已知猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)核蛋白基因(Nucleoprotein,NP)核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增得到目的片段约1400bp,然后克隆入pMD18-T载体...; 袁秀芳王一成徐丽华王方昆; 文献传递

猪流感诊断方法研究进展被引量：13: 2006年; 猪流感即猪流行性感冒,是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。其特征为突发,高热,精神沉郁,食欲废绝,呼吸困难,阵发性咳嗽。猪流感的病死率不高,病猪可康复。近年来,随着集约化养猪规模的不断扩大,猪流感对养猪业构成了较大的威胁。此外,猪流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用,具有重要的公共卫生意义。自1918年首次报道以来,猪流感一直受到人们的广泛关注。研究快速、科学、准确的诊断方法,对于本病的检测和控制具有重要的意义。除常规的临床症状及病理变化诊断外,流感的确诊依赖于实验室诊断方法。文章从病原学、血清学和分子生物学等几个方面对该病的诊断研究进展做了综述。; 王方昆王一成袁秀芳徐丽华; 关键词：猪流感

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浙江省科技计划项目(2004C22044)