军队“十一五”科技攻关课题(06G091)
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
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- 羊布鲁菌BCSP31蛋白表达纯化及其单克隆抗体的制备
- 2009年
- 目的:表达并纯化羊布鲁菌BCSP31蛋白,制备其单克隆抗体(mAb).方法:采用GST亲和层析纯化的方法纯化BCSP31蛋白.用纯化的BCSP31蛋白免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,ELISA间接法筛选阳性克隆,3次克隆化后建立杂交瘤细胞系.采用小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备腹水,正辛酸-硫酸铵法纯化mAb.采用Western Blot和ELISA等方法鉴定mAb特性.结果:GST-BCSP31融合蛋白在25℃诱导时为可溶性表达,经亲和层析纯化,获得BCSP31纯化蛋白0.5 g/L;Western Blot检测结果显示所获蛋白可与兔抗布鲁菌阳性血清特异性反应.获得2株mAb,分别命名为1F1,1E5.结论:BCSP31蛋白的纯化及其mAb的制备为布鲁菌病的诊断与防治奠定了一定的物质基础.
- 张蕾白文涛张芳琳吴兴安史梦远王海涛徐志凯
- 关键词：蛋白纯化单克隆抗体
- 抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定
- 2006年
- 制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体(mAb),为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7/L12的mAb,并用Westernblot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7/L12蛋白的mAb:1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2>2H10>2H9>1B1,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7/L12蛋白。
- 司瑞徐志凯张芳琳白文涛吴兴安王海涛于澜胡刚
- 关键词：单克隆抗体
- 羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定被引量：6
- 2009年
- 布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。
- 张亮张蕾张芳琳李璞媛李凯吴兴安徐志凯白文涛
- 关键词：原核表达
- 布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。
- 司瑞白文涛张芳琳刘艳丽胡刚吴兴安阎岩徐志凯
- 关键词：布鲁菌ELISA
- 羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化被引量：1
- 2010年
- 研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。
- 张蕾张芳琳张亮王海涛胡刚吴兴安徐志凯白文涛
- 关键词：克隆纯化
