目的制备和鉴定鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb)。方法用重组Cor h 1蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白A亲和层析法纯化抗体。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该McAbs的特性和交叉性。结果获得4株可稳定分泌鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的McAbs,其Ig亚型均为IgG1,均具有良好的效价;ELISA和Western Blotting分析表明该4株单抗均能识别重组Cor h 1蛋白,其中3株单抗能够识别天然平榛提取物。结论成功制备了4株鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体,为建立平榛主要变应原Cor h 1检测及纯化方法奠定了基础。
目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。
目的:构建经序列重组的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。方法:根据已鉴定的Ara h 2 IgE抗原表位,利用基因工程技术将Ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。结果:测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blotting和ELISA结果均表明通过基因工程改造的Ara h 2蛋白(S-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论:成功构建了经序列重组的Ara h 2表达载体,该基因表达的重组蛋白具有良好的低致敏原性,这将会为花生过敏患者的脱敏治疗提供了新的安全疫苗基础。
构建经基因工程改造的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性。将花生主要过敏原Arah 2基因序列进行颠换,并将颠换后的序列进行合成,再将合成后的基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;利用Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside(IPTG)诱导表达;通过Ni2+亲和层析纯化目的蛋白;Western blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的过敏原性。测序结果表明合成后的序列成功整合到原核表达载体pET-32a(+)上。重组的目的蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,蛋白大小与理论值相符。Western blotting和ELISA结果均表明经基因工程改造的Ara h 2(F-Ara h 2)蛋白与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏患者混合血清中IgE显著降低。成功构建经基因工程改造的Ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原性。
构建序列重新组合的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。将Ara h 2基因进行合理的缺失和重排,并将重排后的基因T-Ara h 2克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;再用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。测序结果表明重排后的序列成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果均表明:T-Ara h 2与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。成功构建了基因重排的Ara h 2表达载体,该重组蛋白具有良好的低致敏原性。
腰果是引起人们过敏的主要食物之一。作者采用生物信息学方法,通过Pubmed网络服务器、生物信息分析软件SOPMA、swiss-model网络服务器、DNAStar生物分析软件等对腰果主要过敏原Ana o 2的结构和抗原表位进行预测,分析Ana o 2蛋白的抗原表位可能是108-111,181-186,217-218,234-238,244-255,283-287。这为腰果过敏原的进一步研究提供理论参考,并对开发低过敏腰果制品提供帮助。
