国家自然科学基金(30672009)
- 作品数：10 被引量：36H指数：4
- 相关作者：廖飞杨晓兰刘红博甘志勇冯娟更多>>
- 相关机构：重庆医科大学重庆理工大学秦皇岛市第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
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- 尿酸酶在用氧嗪酸建立高尿酸血症模型大鼠体内的降尿酸作用被引量：6
- 2010年
- 目的:用尿酸酶抑制剂氧嗪酸建立高尿酸血症大鼠模型,考察尿酸酶的体内降尿酸作用。方法:大鼠腹腔注射氧嗪酸钾建立高尿酸血症大鼠模型,尿酸酶滤菌后尾静脉注射给药;大鼠眼眶静脉采血,据对尿酸酶Vm/Km的改变测定血浆尿酸酶抑制剂含量,动力学尿酸酶法测定血浆尿酸水平。结果:每天腹腔注射氧嗪酸钾持续7 d后,大鼠血浆尿酸可维持在0.40 mmol/L以上,但大鼠体内尿酸酶抑制剂也维持在很高水平。持续给予氧嗪酸钾21 d,每只大鼠给予0.5 U聚乙二醇修饰尿酸酶,配对t检验发现血浆尿酸有统计显著性下降,但降幅小于12%;给予低剂量或未经修饰尿酸酶则血浆尿酸水平无显著变化。结论:用尿酸酶抑制剂建立的高尿酸血症动物模型评价尿酸酶的降尿酸作用可靠性有限。
- 甘志勇张纯冯娟杨晓兰袁拥华廖飞
- 关键词：高尿酸血症尿酸酶氧嗪酸钾
- 血清尿酸与高尿酸血症相关疾病被引量：20
- 2007年
- 尿酸是人体嘌呤碱基分解代谢终产物,经肾脏排泄。体内尿酸生成超过肾脏排泄时血清尿酸会显著升高,造成高尿酸血症。高尿酸血症与痛风、心血管疾病、肿瘤裂解综合征及肾脏疾病的引发或加剧密切相关。本文对血清尿酸的临床意义进行综述。
- 赵运胜廖飞
- 关键词：血清尿酸高尿酸血症痛风
- 尿酸酶突变体的高通量筛选方法
- 2015年
- 建立一种尿酸酶突变体的高通量筛选方法。将野生型苛求芽孢杆菌尿酸酶及其突变体的表达载体转入大肠杆菌,每个克隆诱导培养后超声裂解上清液为样品,全自动酶标仪测定293 nm光吸收,并分析反应启动后8～28 min的数据计算酶活性,Bradford法测定总蛋白;ROC比较用酶活性或比活性识别阳性突变体的可靠性。任2种突变体酶活性或比活性比值〉2时,ROC分析曲线下面积接近1;当酶活性或比活性仅增加50%时,分析比活性所得曲线下面积比分析酶活性更大,将ROC分析比活性提高近1倍。突变体敏感度达90%时,比活性为判断阳性突变体阈值,其相当于以起始物比活性均值加1.7倍标准差;此阈值能用于高通量筛选变体库中比活性增加1倍以上的阳性突变体。
- 廖娟刘红博高昂杨晓兰李元丽廖飞
- 关键词：尿酸酶
- 维生素C对蟾蜍腓肠肌连续等长收缩期间松弛能力的影响被引量：1
- 2008年
- 目的考察维生素C(VC)对离体蟾蜍腓肠肌连续等长收缩期间松弛能力的影响。方法药物处理30 min后,记录恒压电刺激蟾蜍腓肠肌等长收缩7.0 min内的张力变化,单指数函数加权拟合90%峰张力后的松弛过程,用对应松弛速度和静息张力表征松弛能力。结果抑制内源性抗氧化酶或用2.0 mmol/L VC单独处理对肌肉松弛能力影响很小。抑制超氧化物歧化酶(SOD)后VC可显著升高静息张力并大幅降低松弛速度,但抑制谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶后VC效应很弱。同时抑制SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶后,VC的效应同只抑制SOD相当。结论高浓度VC对富含过渡金属离子复合物而抗氧化能力低的生物体系有氧化毒性,此毒性可能涉及超氧阴离子介导的氧化损伤。
- 李生兵郭睿廖飞左渝萍陆杰孙安平
- 关键词：维生素C
- PEG-5000修饰后假丝酵母尿酸酶的基本特性
- 2010年
- 目的研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的基本特性,为治疗高尿酸血症相关疾病药物做基础研究。方法用相对分子量5kD,活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂对尿酸酶进行修饰,采用常规酶学分析方法,分别研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的动力学参数,并比较修饰前后对抑制剂黄嘌呤的敏感性、最适温度、最适pH值、37℃时的稳定性以及在体半衰期等方面的差异。结果经PEG修饰后尿酸酶最适温度由30℃升为35℃,最适pH无改变仍为pH8.7;在37℃水浴下,24h后活性保留由40%增至70%,酶稳定性提高,体内半衰期由45min延长至11h;测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的Km分别为32.40、36.34μmol/L,黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数分别为4.72、11.30μmol/L。结论假丝酵母尿酸酶经PEG5kD修饰后有药用潜力。
- 孙晓军金磊甘志勇刘冬
- 关键词：高尿酸血症尿酸酶PEG修饰
- 二甲基酚橙法测定尿酸酶活性和识别尿酸酶高活性突变体
- 2013年
- 考察了采用二甲基酚橙测定过氧化氢(Xylenol-orange-assay-of-hydrogen-peroxide,XOAHP)法测定尿酸酶活性的可靠性以及识别高活性尿酸酶突变体的方法.将苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidious)尿酸酶4种突变体成对组合,使其催化效力比值在1.3-4.1间变化;将每种突变体表达载体转化大肠杆菌,取30个克隆分别转移到1.0 mL液体培养基放大,18℃诱导表达16 h,收集细胞后超声裂解得裂解液.在pH 8.9的Tris-HCl缓冲液中0.33 mmol/L以下尿酸对XOAHP法测定尿酸酶活性无干扰.SDS-PAGE分析发现不同突变体蛋白表达丰度有差异,酶活性同裂解液中总蛋白浓度正相关.Receiver-operation-curve(ROC)分析发现尿酸酶间催化效力比值越大,则所得曲线下面积(Area-under-the-curve,AUC)越接近1.00,此比值接近1.8时AUC约0.95.以突变体与起始物的酶活性浓度差值超过起始物标准差1.4倍为阈值,能识别催化效力达起始物1.8倍以上的突变体.因此,用XOAHP法测定裂解液中尿酸酶活性,以起始物活性均值加标准差1.4倍为阈值,有望高通量筛选尿酸酶突变体库.
- 刘苗苗冯娟刘红博杨晓兰冯丽萍李元丽廖飞
- 关键词：尿酸酶突变体高通量筛选ROC曲线
- 共振光散射法可直接表征蛋白质的溶解度被引量：5
- 2020年
- 目的建立一种快捷、灵敏、成本低的蛋白质溶解度的共振光散射(RLS)表征方法,用于蛋白质突变体溶解度比较。方法同步扫描模式下,跟踪RLS信号强度对蛋白浓度的响应,根据响应曲线拐点预测蛋白质相应分散状态的最大浓度,据此定义该状态的溶解度。选择牛血清白蛋白(BSA,0~50.0 g/L),考察pH(6.5、7.0、7.4)、盐离子浓度(0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L)对溶解度测定值的影响;并测定谷胱甘肽S-转移酶同工酶alpha(GSTA,0~27.0 g/L)、Mμ(GSTM,0~20.0 g/L),考察方法通用性。应用RLS测定季也蒙毕赤酵母菌尿酸酶(MGU,0~0.4 g/L)溶解度并指导其突变体溶解度改进。结果所测蛋白质RLS响应曲线均出现两个拐点,低浓度拐点可近似蛋白质单分子分散状态的最大浓度,而高浓度拐点近似蛋白质多分子聚集状态的最大饱和浓度即热力学平衡溶解度。BSA(等电点4.6)两个拐点均随pH的增大(6.5~7.4)而增高,pH7.4 HEPES缓冲液中分别对应~1.2 g/L、~33 g/L,后者与相同条件下商品溶解度接近;加入NaCl使两个浓度拐点均降低,初步表明RLS可直接表征蛋白溶解度。GSTA、GSTM的RLS响应曲线低浓度拐点为~0.7 g/L,~0.8 g/L,高浓度拐点分别为~10 g/L、~11 g/L,均小于BSA,方法有通用性。MGU两个拐点分别对应0.24 g/L和0.30 g/L,而其突变体溶解度提高约2倍。结论共振光散射法可直接表征蛋白质溶解度,且简便、灵敏,蛋白用量少,尤其适用于表达丰度低的蛋白质突变体溶解度的快速比较。
- 陈童同婷婷杨林玉廖飞杨晓兰
- 关键词：蛋白质溶解度共振光散射尿酸酶
- 诊断用苛求芽孢杆菌尿酸酶的剂型与储存方法被引量：1
- 2012年
- 目的:考察重组苛求芽孢杆菌尿酸酶作为诊断试剂的剂型和储存方法。方法:将此重组尿酸酶制成干粉和液体剂型于-18℃和4℃储存,定期测定酶活性;在干粉制剂时加入保护剂于-18℃储存,在液体制剂时加入防腐剂于4℃储存,间隔适当时间监测酶活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离此尿酸酶四聚体和二聚体,染色检测蛋白和酶活性。结果:此尿酸酶干粉和液体制剂在4℃储存28 d后对应的剩余酶活性分别为12%和100%,在-18℃冻存28 d后对应的剩余酶活性分别为24%和92%。在干粉制剂时加海藻糖、蔗糖或甘露醇作为保护剂于-18℃储存56 d后,剩余酶活性对应分别为100%、76%和43%。加叠氮钠或苯甲酸的液体制剂,在4℃储存56 d后对应的剩余酶活性分别为99%和82%。在-18℃储存至无活性的冻干粉制剂经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现此尿酸酶主要以无活性二聚体存在而活性四聚体很少。结论:此尿酸酶作为诊断试剂,可加入叠氮钠制成液体剂型在4℃储存。
- 陈远翔姜海蓉彭方毅廖娟杨晓兰廖飞
- 关键词：酶活性
- 终点平衡尿酸酶法与动力学尿酸酶法联用测定尿酸
- 2011年
- 目的：考察终点平衡尿酸酶法和动力学尿酸酶法联用测定尿酸的可行性和线性范围。方法：在25℃下1.2 ml硼酸钠缓冲液（0.20 mol/L,pH 9.2）中用293 nm吸收跟踪尿酸酶反应;测定加入5μl尿酸酶液前反应体系吸收,加入5μl苛求芽孢杆菌尿酸酶液后记录5.0 min内吸收变化。终点平衡法以尿酸酶反应前吸收为起点而尿酸完全氧化后吸收为本底,二者之差为尿酸净吸收且同尿酸浓度成正比;动力学法分析尿酸酶反应过程预测本底。分析模拟尿酸酶反应曲线,探索从终点平衡法转换为动力学法的尿酸浓度界限值;实验测定联用法的可行性和线性范围。结果：分析40 U/L苛求芽孢杆菌尿酸酶模拟反应曲线,发现两种方法转换的尿酸浓度界限值可为5.0μmol/L;分析实验反应曲线证实此界限值可行。在40 U/L尿酸酶时终点平衡法测量范围1.0~6.0μmol/L;联用法测量范围1.5~60μmol/L且对30μmol/L黄嘌呤有抗性;在5.0μmol/L以下变异系数小于10%而5.0μmol/L以上可小于5%。结论：这种联用法测定尿酸成本更低、线性范围更宽且效率高。
- 龙高波杨宪峰刘红博蒲军杨晓兰廖飞
- 关键词：尿酸联用法
- 产朊假丝酵母尿酸酶的纯化和特性研究被引量：5
- 2008年
- 产朊假丝酵母尿酸酶经2次DEAE-cellulose 52层析后比活性提高20倍以上,SDS-PAGE分析发现其含一种约33.0 kD多肽,Sephadex G-200层析发现此天然尿酸酶分子量约134.0 kD.MALDI-TOF-MS分析比活性>7.0 U/mg样品没有检测到单一肽链,而丰度最高成分为67.7 kD,次高成分为131.4 kD.此酶最适pH值接近8.8,在pH 7.4时可保留50%以上活性,37℃时4 h内稳定,米氏常数为(32.8±3.1)μmol/L(n=10),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2)μmol/L(n=3);用蒸馏水透析后失活90%以上,且随后加NaCl处理后酶活性不能恢复.Cu2+和Fe3+在1.0 mmol/L时对此酶有明显抑制作用.这些结果表明此尿酸酶需通过分子工程改造才能用作治疗高尿酸血症相关疾病的药物.
- 武文明曾昭淳李小彦杨小兰廖飞
- 关键词：产朊假丝酵母尿酸酶高尿酸血症
