浙江省医药卫生科学研究基金(2008B007)
- 作品数：6 被引量：26H指数：3
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- 发文基金：浙江省医药卫生科学研究基金国家自然科学基金博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 靶向ADAM17基因RNA干扰慢病毒载体的构建及慢病毒包装被引量：1
- 2012年
- 目的构建靶向ADAM17基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体及包装慢病毒。方法根据人ADAM17mRNA序列设计4个靶序列,合成4对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上5对寡核苷酸序列退火后连入pLVTHM质粒,经酶切和测序鉴定。将重组慢病毒质粒转染至A549细胞,以Real-time PCR检测A549细胞中ADAM17 mRNA表达。将干扰效果最佳的质粒载体和包装质粒共转染至293T细胞,包装产生病毒颗粒。以流式细胞术检测重组慢病毒的滴度。结果酶切和测序证实干扰靶序列已被准确克隆到pLVTHM质粒载体。pLVTHM-ADAM17-siRNA1-4均可显著抑制A549细胞ADAM17 mRNA的表达,其中pLVTHM-ADAM17-siRNA4的抑制效果最佳。LV-ADAM17-siRNA4重组慢病毒的滴度为2.16×108TU/ml。结论成功构建了靶向人ADAM17基因RNAi慢病毒载体及包装了重组慢病毒。
- 李亚清严建平许武林王宏任卓超陈瑜
- 关键词：RNA干扰慢病毒
- 核因子-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶调节脂多糖诱导的气道上皮细胞白细胞介素8的表达被引量：8
- 2011年
- 目的探讨脂多糖(LPS)对HBE4-E6/E7细胞IL-8表达的影响及Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR-4)、p38MAPK、NF-κB在其中的作用。方法在量效实验中,分别以0、0.1、1、10、100μg.L-1 LPS刺激HBE4-E6/E7细胞24 h;在时效实验中,以10μg.L-1 LPS分别刺激HBE4-E6/E7细胞0、8、12、16、24 h。以100μg.L-1 TAK-242、10 mg.L-1SB202190、50 mg.L-1 PDTC预处理HBE4-E6/E7细胞,以100μg.L-1 LPS刺激24 h。半定量RT-PCR法检测IL-8mRNA表达;酶联免疫吸附试验检测IL-8蛋白水平;凝胶阻滞分析实验检测NF-κB活性。结果 HBE4-E6/E7细胞IL-8 mRNA的表达随LPS刺激剂量的增加明显增加(P<0.05);在24 h内,以10μg.L-1 LPS刺激时,IL-8 mRNA的表达随刺激时间的延长明显增加(P<0.05)。TAK-242、SB202190和PDTC均能明显抑制LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞IL-8 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。TAK-242和PDTC均能明显抑制LPS诱导的NF-κB的活性(P<0.05);SB202190不能抑制LPS诱导的NF-κB活性(P>0.05)。结论 LPS能诱导HBE4-E6/E7细胞IL-8的表达,TLR4、p38MAPK、NF-κB均参与调控LPS诱导的气道上皮细胞IL-8的表达,且p38 MAPK是通过不依赖NF-κB信号途径来参与调节的。
- 李亚清严建平许武林王宏
- 关键词：白细胞介素8核因子-KAPPABP38气道上皮细胞
- 大鼠羊水间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞定向分化的体外实验被引量：2
- 2014年
- 目的：观察体外诱导大鼠羊水间充质干细胞（ AF-MSCs ）向Ⅱ型肺泡上皮细胞的定向分化。方法选取10只清洁级妊娠SD大鼠，收集羊水标本，分离、培养AF-MSCs，以流式细胞术分析其表型标记、实时荧光定量聚合酶链反应（ qRT-PCR）检测Oct-4 mRNA表达（以大鼠胚胎干细胞作为阳性对照）；根据不同体外诱导培养方法，将AF-MSCs分为A（空白对照组）、B、C、D、E共5组，各组体外不同诱导方法处理后qRT-PCR检测肺表面活性蛋白（ SP） A、SPB、SPC、SPD和TTF1 mRNA表达水平，免疫荧光法检测SPA、SPC蛋白水平以及电镜观察嗜锇性板层小体。结果大鼠AF-MSCs在含20％胎牛血清、4μg/L碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM培养基中呈旋涡状生长，第3代AF-MSCs表型标记中 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和 CD166阳性表达率分别为（99.1±7.9）％、（99.2±7.4）％、（75.6±5.2）％、（98.9±8.1）％、（92.9±7.3）％和（89.3±6.7）％，而CD34和CD45表达阴性；Oct-4 mRNA相对表达量（0.690±0.059）显著低于大鼠胚胎干细胞阳性对照（1.000±0.002）（P＜0.01）；体外诱导分化后，A组SPA、SPB、SPC、SPD和TTF1 mRNA及SPA、SPC蛋白均为阴性表达，而B组SPA、SPB、SPC、SPD和TTF1 mRNA相对表达量分别为0.426±0.043、0.368±0.028、0.492±0.058、0.327±0.024和0.183±0.018，均显著高于其他各组（均P＜0.01），SPA、SPC蛋白绿色荧光呈强阳性表达；同时，在B组中观察到嗜锇性板层小体。结论 AF-MSCs在体外能通过特定的诱导定向分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞。
- 顾超严建平许武林李亚清夏英捷陈淳
- 关键词：间质干细胞肺泡上皮细胞
- 慢病毒介导的解整合素-金属蛋白酶17RNA干扰对气道上皮细胞MMP-9表达及NF-κB活性的影响被引量：9
- 2014年
- 目的探讨脂多糖(LPS)诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的TNF-α/NF-κB信号转导机制及慢病毒介导的解整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)RNA干扰(RNAi)对MMP-9表达的影响。方法构建ADAM17 siRNA慢病毒载体、包装重组慢病毒。以NF-κB抑制剂(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)或TNF-α拮抗剂(etanercept)预处理HBE4-E6/E7细胞,以LPS刺激HBE4-E6/E7细胞24 h。以重组慢病毒感染HBE4-E6/E7细胞72 h后,以LPS或TNF-α刺激HBE4-E6/E7细胞24 h。以半定量RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达;以酶联免疫吸附试验检测TNF-α蛋白含量;以Western blot检测MMP-9蛋白表达;以凝胶阻滞分析实验检测NF-κB活性。结果 LPS或TNF-α刺激均明显增加HBE4-E6/E7细胞MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB活性(P<0.05);etanercept和PDTC均明显抑制LPS诱导的MMP-9表达及NF-κB活性(P<0.05)。慢病毒介导的ADAM17 RNAi明显降低LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞上清液中TNF-α蛋白含量(P<0.05),亦明显降低MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB活性(P<0.05),但不能降低TNF-α诱导的MMP-9mRNA和蛋白表达及NF-κB活性(P>0.05)。PDTC明显抑制TNF-α诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB活性(P<0.05)。结论 TNF-α/NF-κB信号通路参与调控LPS诱导的气道上皮细胞MMP-9的表达,ADAM17通过调节TNF-α释放在其信号通路上游起到重要作用。
- 严建平李亚清钟晖陈淳顾超
- 关键词：RNA干扰气道上皮细胞DISINTEGRINMETALLOPROTEINASE
- 解整合素-金属蛋白酶17在呼吸系统疾病中的研究进展被引量：2
- 2011年
- 解整合素金属蛋白酶17（adisintegrinandmetalloproteinase-17，ADAM～17）属于ADAM蛋白酶家族成员之一，又称为肿瘤坏死因子α转化酶，在肿瘤坏死因子α、表皮生长因子等多种跨膜蛋白分子的胞外域剪切脱落过程中起重要作用。ADAM17活性受到转录水平、翻译后修饰及金属蛋白酶组织抑制因子3等多方面调节，活化的ADAM-17在肺癌、重症急性呼吸综合征、慢性阻塞性肺疾病等多种呼吸系统疾病的发生发展中起着重要作用。
- 李亚清严建平许武林
- 关键词：蛋白水解
- Toll样受体4及核因子-κB在脂多糖诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9表达中的作用被引量：4
- 2011年
- 目的探讨Toll样受体4(TLR4)和核因子(NF-)κB在脂多糖(LPS)诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达中的作用,观察TLR4抑制剂TAK-242对MMP-9表达的影响。方法以终浓度为0、0.1、1、10、100μg/L的LPS刺激HBE4-E6/E7细胞24h,或以LPS(终浓度10μg/L)刺激细胞0、8、12、16、24h,检测LPS刺激与MMP-9表达的量效和时效性关系。以TAK-242(100μg/L)或PDTC(50mg/L)预处理HBE4-E6/E7细胞后以100μg/L LPS刺激24h,采用RT-PCR检测MMP-9mRNA表达,用Western blotting检测MMP-9蛋白表达,以明胶酶谱法检测MMP-9酶活性,采用凝胶阻滞实验检测活化NF-κB的含量。结果 MMP-9mRNA表达随着LPS刺激剂量的增加而增加(P<0.05),且随着LPS刺激时间延长,MMP-9mRNA表达量亦显著增加(P<0.05)。TAK-242和PDTC均能显著抑制LPS诱导的MMP-9mRNA和蛋白的表达,降低其酶活性(P<0.05)。TAK-242和PDTC均能显著降低LPS诱导的活化NF-κB含量(P<0.05)。结论 TLR4/NF-κB信号通路在LPS诱导的气道上皮细胞MMP-9表达中发挥着重要的调控作用;TAK-242可抑制LPS诱导的MMP-9的表达。
- 李亚清许武林严建平夏英捷王宏
- 关键词：TOLL样受体4基质金属蛋白酶9上皮细胞呼吸道黏膜
