国家科技重大专项(2008ZX10003011)
- 作品数：15 被引量：73H指数：5
- 相关作者：李柏青金齐力姜丽娜姚春艳吴长有更多>>
- 相关机构：蚌埠医学院中山大学复旦大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 经卡介苗刺激后结核性胸腔积液中记忆性γδT细胞的细胞因子水平及其受体表达被引量：5
- 2010年
- 目的 观察卡介苗刺激后结核性胸膜炎患者的胸腔积液细胞中γδ T细胞的细胞因子及细胞受体表达,了解γδ T细胞在结核病局部细胞免疫应答中的作用.方法 分离结核性胸膜炎患者的胸腔积液细胞,经卡介苗刺激后检测γδ T细胞的细胞因子分泌、细胞亚群、细胞表型及细胞受体表达特征,并提取mRNA,利用3种Vγ和8种Vδ引物,经逆转录PCR扩增cDNA,将PCR产物进行基因扫描分析γδ T细胞各亚家族克隆性.结果 卡介苗刺激胸腔积液细胞后,CD4＋和γδ T细胞分泌γ-干扰素的阳性率分别为0.38%和5.35%,且γδ T细胞分泌γ-干扰素的阳性率远高于CD4＋ T细胞,分泌γ-干扰素的γδ T细胞主要表达白细胞共同抗原（CD45RO）,其阳性率为73.5%.此外,δ2细胞也分泌γ-干扰素（11.1%）和肿瘤坏死因子-α（25.5%）.与未刺激者相比,卡介苗选择性扩增δ2细胞,由多克隆或双克隆转变为寡克隆.结论 卡介苗刺激结核性胸膜炎患者的胸腔积液细胞能诱导记忆性γδT细胞分泌细胞因子,卡介苗体外扩增γδT细胞后,基因扫描显示Vδ2出现寡克隆性.
- 李丽乔丹劳穗华陈少华李扬秋吴长有
- 关键词：细胞因子类卡介苗
- 分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析
- 2011年
- 目的构建分枝杆菌膜锚定表达载体，并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位。方法在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造，人工合成结核分枝杆菌（Myco—bacteriumtuberculosis，Mtb）相对分子质量（Mr）为19×10^3的脂蛋白膜分泌信号序列，将其插入高效的突变型furA基因启动子（pfurAma）下游构建新型的分枝杆菌膜锚定表达载体pMFA42M。PCR扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因，亚克隆至上述两种载体中并电转化耻垢分枝杆菌（Mycobacte—riumsmegmatis，Ms），分别获得重组EGFP融合表达菌株和膜锚定表达菌株；接着将Mtb主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建Mtb抗原-EGFP融合表达菌株；通过Westernblot和流式细胞表面标记技术来分析目标抗原的表达水平及其亚细胞定位，并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度。结果通过引入Mtb19×10^3脂蛋白膜分泌信号，在高效pfurAma启动子的驱动下，成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体。利用EGFP作为标签抗原，通过Westernblot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目标抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上。结论本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体，所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新思路。
- 王鑫范小勇马辉曲勍
- 关键词：分枝杆菌增强型绿色荧光蛋白亚细胞定位
- 结核分枝杆菌感染对THP-1细胞CD14表达的影响被引量：1
- 2012年
- 目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染THP-1细胞后对细胞表面白细胞分化抗原14(CD14)表达的影响。方法:Mtb以10∶1感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞,建立Mtb感染THP-1细胞的模型。采用流式细胞术检测THP-1细胞、PMA分化的THP-1细胞及Mtb感染THP-1细胞CD14的表达。结果:THP-1细胞和PMA分化的THP-1细胞表面表达CD14的阳性率分别为5.5%和21.6%,对Mtb的吞噬率分别为7.7%和93.0%;Mtb感染的THP-1细胞表面表达CD14的阳性率为27.5%。结论:PMA分化后的THP-1细胞表面CD14的表达增加,Mtb感染后CD14的表达进一步增加,对Mtb的吞噬率增加。
- 金齐力韦莉李柏青
- 关键词：结核分枝杆菌THP-1细胞白细胞分化抗原14
- 耻垢分枝杆菌黏膜接种对小鼠过敏性哮喘的免疫调节作用被引量：5
- 2011年
- 目的观察耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)对过敏性哮喘小鼠防御素β-2(Defb2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、IFN-γ、IL-4及过敏原特异性IgE、IgG1、IgG2a表达的影响,探讨Ms黏膜接种干预哮喘的免疫调节机制。方法 SPF级BALB/c小鼠随机分为哮喘组、干预组、对照组3组。以卵清蛋白(OVA)致敏,气道激发建立哮喘模型。OVA致敏前7 d鼻黏膜接种Ms进行干预。以Real-time荧光定量PCR法检测肺组织Defb2、MIP1、MIP2 mRNA的表达,ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)、纵膈淋巴结细胞培养上清中MIP1、MIP2、IFN-γ、IL-4的浓度,ELISA法检测血清总IgE以及OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a水平。结果 Ms干预可以显著增高哮喘小鼠Defb-2 mRNA的表达(31.21±1.56对0.78±0.11,P<0.01);Ms干预可使哮喘小鼠表达增高的MIP1 mRNA降低(9.80±1.56对2.44±0.96,P<0.05),但对MIP2 mRNA的影响不明显(P>0.05);Ms干预可使BALF和淋巴结培养上清中MIP1、MIP2降低,使BALF和淋巴结培养上清中IL-4降低(97.43±7.83对153.80±5.20,150.75±54.58对625.81±55.98,P均<0.01),使BALF中IFN-γ升高(78.92±11.41对44.88±3.26,P<0.01);Ms干预可以显著降低哮喘小鼠血清总IgE、OVA-IgE、OVA-IgG1,升高OVA-IgG2a,降低哮喘小鼠OVA特异性IgG1/IgG2a比值(1.09±0.03对1.42±0.04,P<0.01)。结论 Ms黏膜免疫可以通过促进Defb-2表达增强哮喘小鼠抗感染能力,通过降低巨噬细胞炎症蛋白表达、调节Th1/Th2平衡、抑制过敏原特异性IgE表达等途径干预哮喘,耻垢分枝杆菌有望继卡介苗之后成为哮喘预防的另一候选疫苗。
- 郭盛吴良霞范小勇郝春莉马辉陈凌张建华
- 关键词：哮喘耻垢分枝杆菌巨噬细胞炎症蛋白防御素
- 白细胞介素17对结核病患者中性粒细胞凋亡的影响被引量：4
- 2014年
- 目的 探讨白细胞介素-17（IL-17）对结核病患者外周血中性粒细胞（PMN）凋亡的影响以及可能涉及的信号通路。方法 取结核病患者和健康人外周血PMN培养0-24 h, annexinⅤ染色后流式细胞术检测PMN凋亡率; 或加不同浓度IL-17刺激培养24 h再检测PMN凋亡率; 或用MAPK特异性抑制剂U0126预处理30 min 后, 再加IL-17培养24 h后检测PMN的凋亡。结果 结核病患者和正常人PMN凋亡率均随培养时间延长而增加（P〈0.05）, 结核病患者PMN在0、6、12、24 h 时的annexin Ⅴ＋细胞分别为（4.49±1.39）%、（21.89±2.90）%、39.96±4.15）%、（68.35±7.01）%, 均分别高于正常人组的（2.65±0.75）%、（11.00 ±1.72）%、（25.84±3.90）%, （45.59±4.10）%（P〈0.05）。而经IL-17刺激后, 结核病患者与正常人PMN的凋亡率, 在IL-17 0.5 μg/L组, 分别为（59.81±7.19）%和（34.65 ±4.79）%; 在IL-17 5 μg/L组, 分别为（51.62±6.91）%和（29.04±3.62）%; 均低于未加IL-17对照组（68.35±7.01）%和（45.59±4.10）%（P〈0.05）; 而在IL-17 50 μg/L组, 凋亡率则分别达到（76.04±5.59）%和（53.24±4.62）%, 明显高于对照组（P〈0.05）。预先用U0126处理, 可大部分阻断IL-17对结核病患者和正常人PMN凋亡的抑制作用。结论 结核病患者和正常人PMN凋亡率均随培养时间延长而增加, 且结核病患者PMN凋亡率高于正常人。IL-17较低浓度延迟凋亡, 较高浓度促进凋亡。IL-17抑制PMN凋亡的作用和ERK途径有关。
- 姜丽娜姚春艳金齐力李柏青
- 关键词：结核中性粒细胞白细胞介素-17
- 结核病患者中性粒细胞表面Toll样受体2和Toll样受体4的表达及意义被引量：9
- 2012年
- 目的:检测结核病患者外周血中性粒细胞(PMN)体外感染结核分枝杆菌(M.tb)前后表面Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)的表达,并探讨其意义。方法:采用流式细胞仪检测结核病患者PMN表面TLR2和TLR4的表达,同时检测正常人PMN表面TLR2和TLR4的表达率;再用M.tb感染结核病患者和正常人外周血,检测PMN表面TLR2和TLR4表达情况。结果:结核病患者外周血感染M.tb前PMN表面TLR2和TLR4表达率明显高于正常人(P<0.01);结核病患者和正常人外周血在感染M.tb后PMN表面TLR2和TLR4表达率均较感染前明显降低(P<0.01)。结论:结核病患者PMN表面TLR2和TLR4的表达和活化有助于机体抵御结核感染,TLR2和TLR4共同参与了宿主对M.tb的免疫应答。
- 姜丽娜姚春艳金齐力李柏青
- 关键词：结核中性粒细胞TOLL样受体2TOLL样受体4
- 结核胸液中ESAT-6多肽特异性多功能CD4^+ T细胞数量及功能分析被引量：16
- 2011年
- 目的:检测ESAT-6多肽刺激后,结核性胸膜炎患者胸液细胞中CD4+ T细胞细胞因子产生及多功能CD4+ T细胞频率,了解ESAT-6特异性CD4+ T细胞在结核局部细胞免疫应答中的作用。方法:分离结核性胸膜炎患者胸液细胞(PFCs),ESAT-6混合多肽刺激后检测CD4+ T细胞细胞因子分泌、细胞亚群、多功能性CD4+T细胞频率及细胞因子平均荧光强度。结果:BCG、ESAT-6混合多肽和ESAT-6重组蛋白刺激PFCs后,主要是CD4+T细胞分泌Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α),而CD8+ T细胞几乎不产生细胞因子。进一步分析ESAT-6混合多肽刺激PFCs后Th1细胞的亚群组成,依据细胞因子分泌的类型及数量,该特异性Th1细胞可以分为7个不同亚群,且各亚群所占比例不同,其中多功能性T细胞亚群(同时分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α)比例较高。细胞因子荧光强度分析表明,依据细胞因子分泌类型的增加,单个细胞水平上不同Th1亚群中各细胞因子表达的量也逐渐增加,即3+>2+>1+细胞。结论:ESAT-6混合多肽刺激结核性胸膜炎患者胸液细胞后,主要诱导CD4+ T细胞分泌细胞因子,且Th1亚群中包含多功能性CD4+ T细胞,该细胞在单细胞水平上分泌细胞因子的类型和数量也显著高于其他亚群,可能在结核局部感染中发挥关键保护性作用。
- 李丽乔丹李琴张贤兰劳穗华吴长有
- 关键词：CD4+T细胞
- IL-15对人γδT细胞杀伤结核杆菌感染THP-1细胞的影响被引量：2
- 2010年
- 目的建立结核杆菌(Mtb)感染单核细胞THP-1细胞系模型;用流式细胞术检测人γδT细胞对Mtb感染THP-1细胞的细胞毒活性;并观察IL-15对人γδT细胞杀伤Mtb感染THP-1细胞的细胞毒活性的影响。方法 Mtb以10∶1的比例感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞,建立Mtb感染细胞模型。人外周血单个核细胞用Mtb耐热性低分子多肽类抗原刺激优势扩增γδT细胞,作为效应细胞用于细胞毒活性实验。用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记Mtb感染THP-1细胞,作为靶细胞。效应细胞和靶细胞以不同比例孵育4 h,用碘化丙啶(PI)染色后在流式细胞仪上检测,CSFE和PI双阳性细胞为被杀伤靶细胞。IL-15作用于γδT细胞24 h后,再检测γδT细胞对Mtb感染THP-1细胞的细胞毒活性。结果人γδT细胞与Mtb感染THP-1细胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后,人γδT细胞对结核杆菌感染的THP-1细胞的细胞毒活性从22.5%增加至80.7%;而γδT细胞与未感染Mtb的THP-1细胞的细胞毒活性为16.1%至47.2%。IL-15作用γδT细胞后的细胞毒活性(64.06%)与对照组(46.81%)相比明显增加(P<0.05)。结论人γδT细胞对Mtb感染THP-1细胞的杀伤活性明显高于对未感染Mtb的THP-1细胞的作用,杀伤活性随效靶比的增加而增加。IL-15可以增强人γδT细胞对Mtb感染巨噬细胞的细胞毒活性。
- 金齐力韦莉姜丽娜姚春艳李柏青
- 关键词：IL-15结核杆菌ΓΔT细胞THP-1细胞
- 分枝杆菌同源可控表达系统的建立及其应用被引量：2
- 2009年
- 目的构建分枝杆菌可控表达载体，利用其过表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的免疫保护性抗原，亲和层析纯化后分析免疫原性。方法应用PCR扩增耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms）乙酰胺酶编码基因启动子（pACE），构建分枝杆菌可控表达载体pMF系列；克隆Mtb嵌合抗原编码基因并用乙酰胺进行诱导表达，以Ni^2＋亲和层析纯化重组蛋白；并用该重组嵌合抗原Ag856 A2对卡介苗（BCG）免疫的小鼠脾细胞进行体外刺激，以IFN-γ酶联免疫斑点技术（ELISPOT）分析其免疫原性。结果成功构建了分枝杆菌可控表达载体pMF系列，利用0．02％乙酰胺进行诱导可实现目标抗原在Ms中的高水平表达；同时利用引入的6×Ilis标签可方便实现重组抗原的一步纯化，且该同源表达重组抗原可诱导更高水平IFN-γ的分泌。结论以Ms乙酰胺酶编码基因启动子pACE为基础构建的分枝杆菌可控表达系统可实现Mtb抗原在Ms中的高水平表达与纯化，与大肠杆菌异源表达相比，该同源表达重组抗原具有更好的免疫原性。
- 范小勇马辉郭建朱召芹郭盛淇赵国屏
- 关键词：分枝杆菌启动子
- 八色流式细胞术检测人外周血BCG特异性效应型记忆CD4^+ T细胞的表型特征被引量：3
- 2011年
- 目的:检测BCG刺激后,PPD+正常人外周血中细胞因子产生及其亚群。方法:分离PPD+正常人外周血单个核细胞(PBMC),BCG刺激后检测CD4+和CD8+ T细胞细胞因子分泌,并用八色流式细胞术分析BCG特异性T细胞亚群。结果:BCG刺激PBMC后,主要是CD4+T细胞分泌Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α),而CD8+T细胞几乎不产生细胞因子。进一步分析分泌细胞因子的细胞亚群,主要是CD4+CD45RO+CD62L-CD27-和CD4+CD45RO+CD62L-CD27+分泌细胞因子。结论:BCG刺激PPD+正常人外周血PBMC后,主要诱导CD4+ T细胞分泌细胞因子,且该细胞表现出CD4+CD45RO+CD62L-效应型记忆细胞特征,可能在预防结核感染中发挥重要作用。
- 李丽付笑迎吴长有
- 关键词：CD4+T细胞免疫记忆
