国家自然科学基金(30970122)
- 作品数：8 被引量：16H指数：2
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- 志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的表达、纯化及多克隆抗体制备
- 2013年
- 目的:克隆编码志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的基因phoN2并实现表达,纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠抗Apyrase的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行评价。方法:通过PCR扩增的志贺菌5a M90T中的基因phoN2克隆至表达载体pET24a中,将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达并纯化Apyrase-HIS融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多抗。Western blot、ELISA、免疫荧光鉴定获得的抗血清。结果:成功构建了原核表达载体pET24a-Apyrase,经诱导表达出相对分子量为28 kD的融合蛋白,用纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备的多克隆抗体,通过Western blot、ELISA、免疫荧光法证明多克隆抗体制备成功。结论:成功制备了志贺菌福氏5a特异性的鼠多克隆抗体,为进一步研究Apyrase蛋白在志贺菌福氏5a M90T中的表达、定位及志贺菌福氏5a M90T的快速检测奠定了基础。
- 王羽周围廖翔高原戴红梅岳俊杰梁龙呼和巴特尔
- 关键词：APYRASE多克隆抗体
- 福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定被引量：6
- 2014年
- 目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。
- 王羽廖翔岳俊杰周围梁龙呼和巴特尔
- 关键词：3-磷酸甘油醛脱氢酶多克隆抗体
- 双向BN/SDS-PAGE分离鉴定痢疾杆菌福氏5型M90T株毒力相关膜蛋白复合物被引量：5
- 2011年
- 通过蓝色非变性凝胶电泳(BN-PAGE)比较痢疾杆菌福氏5型野生株M90T和大质粒缺失株M90TΔT的膜蛋白复合物,发现一个野生株特有的复合物,其分子量约为290 kD,命名为M90T-290。通过第二向SDS-PAGE分离M90T-290得到6个蛋白亚基,质谱鉴定为:一个由大质粒编码的毒力蛋白Apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和5个染色体编码的蛋白,这些蛋白可能以膜复合物的形式影响毒力蛋白IcsA的单极性分布和痢疾杆菌在细胞间的扩散。这个新发现的毒力相关膜复合物在痢疾杆菌的致病过程中可能发挥重要作用。
- 龚益熊廖翔朱力吴兰周晓巍梁龙黄培堂
- 关键词：痢疾杆菌膜蛋白复合物毒力
- 志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定被引量：2
- 2015年
- 目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。
- 王羽周围廖翔岳俊杰宋婷戴红梅陈欣欣梁龙呼和巴特尔
- 关键词：热休克蛋白70多克隆抗体
- 弗氏志贺菌M90T株毒力相关膜蛋白复合物组成基因缺失突变体的构建被引量：1
- 2012年
- 目的:构建弗氏志贺菌M90T株毒力相关膜蛋白复合物组成蛋白基因的缺失突变株。方法:分别扩增目的基因的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段,利用重叠延伸PCR技术将这3个片段融合为打靶片段,电击转化M90T/pKD46感受态细胞,在λRed重组系统的作用下,通过同源重组将目的基因置换为卡那霉素抗性基因,之后在辅助质粒pCP20的作用下切除FRT位点之间的卡那霉素抗性基因,得到基因缺失突变体。结果与结论:分别构建了M90T株毒力相关膜蛋白复合物4个组成蛋白Apy、DnaK、ClpB、YdgA的基因缺失突变体,为进一步研究各基因的功能提供了突变体。
- 冉金宝廖翔周围王羽魏波高原岳俊杰梁龙王纯洁
- 关键词：膜蛋白复合物缺失突变株重叠延伸PCR
- 弗氏志贺菌5a型M90T株ClpB蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化被引量：1
- 2012年
- 目的:构建弗氏志贺菌clpB基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果:PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574 bp的clpB基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法(LIC)进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1 mmol/L IPTG诱导2 h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×103的ClpB-T7融合蛋白。结论:实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。
- 王羽周围廖翔魏波冉金宝高原呼和巴特尔岳俊杰梁龙
- 串联亲和纯化原核表达载体的构建被引量：1
- 2012年
- 【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding peptide,SBP)标签;以pUC18载体为骨架,去除原有的阻遏蛋白基因,构建组成型表达载体pNTAP和pCTAP。【结果】成功构建N端和C端标签表达载体pNTAP和pCTAP,它们在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、肠出血性大肠杆菌O157:H7和痢疾杆菌福氏5型M90T菌株中都可以实现表达。【结论】本实验构建的两个串联亲和纯化表达载体可以在部分革兰氏阴性细菌中表达,为研究细菌内蛋白-蛋白相互作用及致病菌毒力蛋白的作用机制奠定了基础。
- 魏波廖翔周围高原王羽冉金宝梁龙岳俊杰呼和巴特尔
- 关键词：原核表达载体串联亲和纯化蛋白相互作用
- 利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌GroEL蛋白复合物被引量：1
- 2011年
- 肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的致病菌,加深其致病机理的基础研究将为相关疫苗研究及疾病控制等提供新的思路和依据。串联亲和纯化(TAP)技术是最近发展的分离纯化天然状态蛋白质复合物进而研究蛋白质相互作用的新方法。用我们自己构建的原核表达串联亲和标签载体,在大肠杆菌O157:H7中表达了标签融合蛋白GroEL-TAP,建立了非变性条件下制备蛋白复合物的方法,并且对串联亲和纯化过程中的相关实验条件进行了探索和优化,最终得到了高纯度的GroEL-TAP与天然GroEL形成的嵌合型多聚体复合物。这表明我们建立的串联亲和纯化技术能高度特异地纯化靶蛋白参与形成的复合物,为后续寻找O157:H7中毒力蛋白参与形成的复合物奠定了实验基础。
- 魏波廖翔周围王羽李玉霞高原岳俊杰梁龙呼和巴特尔
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7
