贝朗麻醉科学研究基金(2007)
- 作品数：6 被引量：12H指数：3
- 相关作者：刘希江高峰田玉科杨辉徐懋更多>>
- 相关机构：北京大学第三医院华中科技大学聊城市人民医院更多>>
- 发文基金：贝朗麻醉科学研究基金国家教育部博士点基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- β-arrestin 2抗基因RNA慢病毒表达载体的构建与鉴定被引量：4
- 2011年
- 目的构建携带β-arrestin 2抗基因RNA的慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法将线性化的慢病毒载体pGC-FU与抗基因RNA在In-Fusion交换酶作用下构建目的质粒pGC-agRNA,转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在工具细胞NG108-15细胞的转染效率。结果抗基因RNA被成功构建入慢病毒表达载体pGC-FU,病毒滴度为2×109TU/mL。用该慢病毒感染NG108-15细胞,当感染复数(MOI)为100时,感染效率大于95%。结论成功构建了携带β-arrestin 2抗基因RNA的慢病毒表达载体,为研究β-arrestin 2在μ阿片受体调控机制中的作用提供了有效的研究工具,而且为抗基因RNA技术应用于体内外实验研究奠定了基础。
- 卜慧莲温晓岩刘希江徐懋曹菲田学愎杨辉高峰田玉科
- 关键词：基因沉默慢病毒
- β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究被引量：1
- 2011年
- 目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达。方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达。结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05)。感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05)。结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达。成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础。
- 刘希江高峰卜慧莲徐懋曹菲田学愎杨辉田玉科
- 关键词：基因沉默慢病毒载体铁蛋白
- HPLC-紫外法测定人血浆中舒芬太尼浓度被引量：3
- 2011年
- 目的建立高效液相色谱法-紫外检测器测定人血浆中舒芬太尼浓度的方法。方法以芬太尼为内标,采用内标法进行定量,用正己烷-无水乙醇(19:1,V/V)进行液-液萃取。采用Diamonsil C18柱(4.6mm×200mm,5μm),流动相为乙腈:0.015mol/L KH2PO4缓冲液(31:69,V/V,pH=3.0),流速1.0ml/min,监测波长为200nm。结果标准曲线在2～500ng/mL范围内线性关系良好(r=0.9996),最低检测浓度为1ng/mL,方法回收率为(99.36±2.75)%,提取回收率为(98.53±2.49)%,日内变异RSD(6.75±6.18)%,日间变异RSD(6.07±5.85)%。结论本方法简便、准确、检测浓度低,能够满足血浆中低浓度舒芬太尼的测定及临床药代动力学研究的要求。
- 吴巧玲王玲玲马虹王俊科
- 关键词：高效液相色谱法舒芬太尼血浆
- 重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建
- 2011年
- 目的构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体。方法将铁蛋白重链基因构建人线性化的慢病毒载体pGC-FU，以获得中间质粒DGC-U-HF；进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒，以获得目的质粒pGC-agRNA-HF；通过病毒的包装和浓缩，应用RealtimePCR法检测重组慢病毒的滴度，应用NGl08-15细胞，采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达。结果抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体，病毒滴度2．00×109TU／ml，该病毒转染NGl08．15细胞后，β-arrestin2表达下调，铁蛋白表达上调。结论成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体。
- 高峰温晓岩刘希江卜慧莲曹菲田学愎杨辉王鹏田玉科
- 关键词：RNA慢病毒属
- β-arrestin2抗基因RNA表达载体的构建及其基因沉默效应鉴定被引量：4
- 2010年
- 目的吗啡耐受与神经元μ阿片受体持续脱敏感化有关,而μ阿片受体调控蛋白β-arrestin2在其中起着关键性作用,因此β-arrestin2有可能成为抑制吗啡耐受状态的有效靶点。文中构建携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体pGPU6/GFP/agRNAs,并评价其用于基因沉默研究的可行性。方法根据β-arrestin2基因转录起始位点序列,从-14处开始至+13处结束,每隔一个碱基,依次合成9条21个碱基长度的抗基因RNA片段,并分别构建入质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo。利用脂质体Lipofectamine介导的基因转染技术,分别将各个表达载体转染NG108-15细胞,于转染后第5天分别取转染不同抗基因RNA片段的细胞提取总RNA,应用realtime PCR和Western blot检测细胞β-arrestin2的表达,评价其基因沉默效应。结果筛选出1个表达具有基因沉默效应的抗基因RNA表达载体pGPU6/GFP/Arrb9。Realtime PCR结果显示NG108-15细胞转染该片段后,β-arrestin2 mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05),下降程度达95%。结论携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体可有效下调NG108-15细胞β-arrestin2的表达,实现基因沉默效应。
- 高峰陈莎莎徐懋刘希江吴震曹菲许爱军田学愎田玉科杨辉
- 关键词：基因沉默
- β-arrestin 2抗基因RNA对小鼠C17.2神经干细胞μ阿片受体脱敏感化的影响被引量：1
- 2010年
- 背景:前期实验中采用新型基因沉默方法——抗基因RNA下调了细胞内β-arrestin 2基因的表达,实现细胞水平的基因敲除效应。目的:在前期实验基础上,观察抗基因RNA下调小鼠C17.2神经干细胞β-arrestin 2基因表达后其对DAMGO诱导μ阿片受体脱敏感化的影响。方法:小鼠C17.2神经干细胞应用含体积分数为10%胎牛血清、10mg/L青霉素和10mg/L氨苄青霉素的DMEM培养基,置于37℃,体积分数为5%CO2培养箱进行培养。待细胞长至80%汇合,用0.25%胰蛋白酶消化传代,每五六天传代1次。通过RT-PCR和免疫细胞化学法检测C17.2细胞μ阿片受体的表达。在脂质体介导下,将已被证实具有基因沉默效应的抗基因RNA片段转染C17.2细胞,荧光显微镜下观察转染24h后绿色荧光蛋白的表达。应用μ阿片受体选择性激动剂DAMGO和[35S]GTPγS结合实验检测C17.2细胞μ阿片受体与G蛋白的耦联能力。结果与结论:RT-PCR结果证实C17.2细胞内有μ阿片受体存在,而免疫细胞化学结果显示μ阿片受体主要在细胞膜和细胞浆中表达。荧光显微镜下观察可见转染质粒pGPU6/GFP/Arrb9的C17.2细胞中有绿色荧光蛋白的表达。[35S]GTPγS结合实验结果显示:未应用DAMGO进行处理的细胞中,[35S]GTPγS结合的刺激比率为(253±17)%;应用DAMGO预先对细胞进行处理后,刺激比率降为(113±14)%(P<0.05);而转染β-arrestin 2抗基因RNA的细胞在DAMGO刺激下,[35S]GTPγS结合的刺激比率则仍维持在(239±15)%,表明抗基因RNA下调β-arrestin 2的表达,可抑制μ阿片受体脱敏感的产生。
- 高峰陈莎莎刘希江徐懋杨辉田玉科
- 关键词：基因沉默Β-ARRESTIN阿片受体神经干细胞
