国家自然科学基金(81172017)
- 作品数：17 被引量：69H指数：5
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- 人siALK2重组腺病毒的构建及其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭的影响被引量：2
- 2013年
- 用前期设计并合成好的重组腺病毒质粒pAdsiALK2,经Pac I酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定,以重组腺病毒siALK2(AdsiALK2)感染MDA-MB-231细胞,以含RFP的腺病毒作为感染对照,并设空白对照组。通过RT-PCR验证MDA-MB-231细胞中ALK2表达显著下降;MTT法、平板集落形成试验、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验证实MDA-MB-231/siALK2组相比MDA-MB-231/RFP组细胞的增殖活力、集落形成率及划痕愈合率均显著降低(P<0.05),穿膜细胞数也明显减少(P<0.05),而MDA-MB-231/RFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。该研究表明,下调ALK2表达后可以在体外抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移与侵袭。
- 费嫦王林孙笑笑刘月红万绍恒王维陈莹莹王婷张彦
- 关键词：重组腺病毒乳腺肿瘤细胞增殖细胞运动肿瘤浸润
- 整合素β2促进人乳腺癌细胞MCF-7的迁移,侵袭与粘附被引量：11
- 2019年
- 本研究主要目标为探讨整合素β2 (ITGB2)的高表达对人乳腺癌细胞MCF-7迁移,侵袭与粘附能力的影响。本研究首先构建了ITGB2过表达质粒,实验设阴性对照组(pcDNA-3.1+)与ITGB2基因过表达组(pcDNA-3.1+/ITGB2)。ITGB2过表达质粒转染MCF-7细胞后,采用逆转录PCR与Western blotting方法分别检测ITGB2 mRNA转录水平与蛋白翻译水平;流式细胞术检测细胞周期的改变;划痕实验检测细胞横向迁移能力;Transwell小室实验检测细胞纵向迁移能力及侵袭能力;人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)粘附实验检测癌症细胞与血管内皮细胞之间的粘附能力,Western blotting实验检测侵袭相关指标MMP9,整合素经典通路中FAK蛋白磷酸化水平的改变。研究结果表明:转染ITGB2过表达质粒后,MCF-7细胞中ITGB2的m RNA水平(p<0.01)与蛋白水平(p<0.05)均显著增高;流式细胞术实验中,实验组S期的细胞所占比例与对照组无明显差异;划痕实验与Transwell小室实验中,实验组的迁移侵袭能力显著性增强;人脐静脉血管内皮细胞粘附实验中,实验组乳腺癌细胞与血管内皮细胞的粘附能力强于对照组(p<0.05);且Western blotting结果显示MMP9和p-FAK蛋白水平明显上升。由以上结果可得出结论,过表达ITGB2后会增强人乳腺癌细胞MCF-7的迁移、侵袭与粘附能力,而对其增殖能力无明显影响。
- 刘梦瑶苟理尧夏菁姜亚运万群唐敏孙恃雷张彦
- 关键词：乳腺癌迁移粘附
- BMP9对人乳腺癌细胞MDA-MB-231骨转移的影响及可能机制被引量：2
- 2012年
- 探讨BMP9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞骨转移能力的影响及其可能的机制。扩增高滴度的BMP9表达腺病毒,感染MDA-MB-231细胞,制备表达BMP9的重组MDA-MB-231/BMP9细胞,以此作为实验组;同时以含GFP的空载腺病毒感染该细胞为MDA-MB-231/GFP,联合MDA-MB-231共同作为对照组;RT-PCR及Western blot检测重组MDA-MB-231/BMP9细胞中BMP9以及磷酸化Smad1(PSmad1)的表达;定量PCR及Western blot检测三组细胞中CTGFmRNA和蛋白水平的表达情况,最后结合X片运用免疫组织化学染色的方法检测三组标本中CTGF的表达。结果发现重组MDA-MB-231/BMP9细胞中存在BMP9的表达;与对照组细胞相比,MDA-MB-231/BMP9细胞中存在PSmad1的活化增强及CTGF的表达下调;X片发现实验组裸鼠胫骨溶骨性缺损减少;瘤体组织免疫组化发现实验组CTGF表达下调。所以BMP9可以在体内抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的骨转移并且这种抑制作用有可能是通过下调CTGF来实现的。
- 徐欣李杰孙笑笑王科冯红蕾刘月红万绍恒罗进勇张彦
- 关键词：骨转移CTGF乳腺癌
- Hsa-miR-5195-3p对人宫颈癌细胞SiHa增殖、迁移与侵袭的影响被引量：6
- 2020年
- 目的:探讨mi R-5195-3p对人宫颈癌细胞系Si Ha增殖、迁移与侵袭的影响。方法:采用qRT-PCR检测人宫颈癌细胞SiHa和正常上皮细胞HaCaT中mi R-5195-3p的表达水平。将mi R-5195-3p mimic转染至Si Ha细胞中构建外源性过表达细胞株,阴性对照组中则转染NC mimic,并用q RT-PCR验证转染效率;通过MTT和集落形成实验检测细胞增殖能力;划痕愈合实验检测细胞横向迁移能力;Transwell小室实验检测细胞纵向迁移能力和侵袭能力;采用qRT-PCR和Western blot检测E-cadherin、Vimentin与snail m RNA转录水平及蛋白表达水平。结果:宫颈癌细胞Si Ha中的mi R-5195-3p表达水平较HaCaT偏低(P<0.05)。与阴性对照组相比,转染mi R-5195-3p mimic的SiHa细胞中mi R-5195-3p水平显著增高(P<0.01);并且其体外增殖(P<0.001),迁移(P<0.001)与侵袭能力(P<0.001)明显减弱;同时E-cadherin表达水平上调而Vimentin、snail表达水平下调。结论:过表达mi R-5195-3p可能通过阻碍EMT通路抑制宫颈癌细胞Si Ha的增殖,迁移与侵袭。
- 唐敏万群孙恃雷胡静孙子久方玉婷张彦
- 关键词：宫颈癌增殖迁移
- 体外模拟乳腺脂肪微环境中过表达BMP9对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及其机制探讨被引量：1
- 2014年
- 目的 :采用体外共培养技术模拟乳腺脂肪微环境,研究人骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移的影响,并初步探讨其可能的机制。方法 :将重组腺病毒Ad-BMP9(以Ad-GFP作为对照)导入MDA-MB-231细胞中,构建MDA-MB-231/Ad-BMP9重组细胞,再与前体脂肪细胞3T3-L1在Transwell共培养体系中间接共培养3 d。荧光显微镜下观察共培养体系中重组腺病毒Ad-BMP9在MDA-MB-231细胞中的感染效率,并通过RT-PCR和蛋白质印迹法验证BMP9在共培养体系的MDA-MB-231细胞中成功过表达。然后,分别采用MTT法、FCM法、划痕愈合实验和Transwell迁移实验检测MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力的变化;蛋白质印迹法检测共培养的2种细胞中增殖和转移相关因子瘦素(leptin)的表达水平变化;细胞免疫荧光法和蛋白质印迹法分别检测MDA-MB-231细胞中leptin受体OB-R及leptin信号通路关键分子的表达水平变化。结果 :荧光显微镜下观察到重组腺病毒Ad-BMP9在共培养体系的MDA-MB-231细胞中感染效率为70%左右,且BMP9在共培养体系的MDA-MB-231细胞中成功过表达(P<0.05)。在模拟乳腺脂肪微环境的共培养体系中过表达BMP9后,乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移受到明显抑制(P<0.05),并且细胞周期阻滞于G2/M期(P<0.001)。过表达BMP9后,前体脂肪细胞3T3-L1中leptin表达显著下调(P<0.05),而MDA-MB-231细胞中磷酸化的STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)和磷酸化的ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)水平均明显下调(均P<0.05)。结论 :模拟乳腺脂肪微环境的共培养体系中,BMP9过表达可以调节乳腺癌细胞与前体脂肪细胞的相互作用,抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移,且该抑制作用可能与leptin经典信号通路有关。
- 张志慧王维陈莹莹王婷王晋蜀姜亚运张彦
- 关键词：骨形态发生蛋白质类脂细胞细胞增殖
- BMP9对体外模拟骨微环境中乳腺癌细胞迁移和凋亡的影响及其机制探讨被引量：5
- 2013年
- 目的:采用体外共培养技术模拟骨微环境,研究人骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)对人高骨转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法:将重组腺病毒AdBMP9导入MDA-MB-231细胞中,与骨髓基质细胞HS-5在Transwell共培养体系中培养3d。然后,采用划痕愈合实验、Transwell小室和FCM法检测MDA-MB-231细胞迁移和凋亡的变化;RT-PCR法检测共培养的2种细胞中基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)、白细胞介素-6(interleukin6,IL-6)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)等转移相关因子的水平;细胞免疫荧光法检测MDA-MB-231细胞中趋化因子受体CXCR4的表达;蛋白质印迹法检测2种细胞中SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路关键分子的表达水平变化。结果:在模拟骨微环境的共培养体系中过表达BMP9后,乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移受到明显抑制(P<0.05),而肿瘤细胞凋亡增加(P<0.001)。过表达BMP9后,骨髓基质HS-5细胞中转移相关因子SDF-1、IL-6和MCP-1表达显著下调(P<0.05),但MDA-MB-231细胞中SDF-1表达水平无明显变化,IL-6和MCP-1的表达也明显下调。另外,MDA-MB-231细胞中本身CXCR4阳性,BMP9过表达对MDA-MB-231细胞中CXCR4表达无明显影响,但可以下调其配体SDF-1在HS-5细胞中的表达水平,且MDA-MB-231细胞中磷酸化的Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)水平也被下调(P<0.05)。结论:模拟骨微环境的共培养体系中,BMP9过表达可以调节乳腺癌细胞与骨髓基质细胞的相互作用,抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移,并促进其凋亡,且该抑制作用可能与SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路有关。
- 王维陈莹莹刘月红万绍恒张志慧王婷张彦
- 关键词：乳腺肿瘤肿瘤转移骨形态发生蛋白质类骨髓细胞
- 双氢青蒿素对人骨肉瘤细胞株143B增殖和凋亡的作用被引量：16
- 2012年
- 目的观察双氢青蒿素(dihydroarteminin,DHA)对人骨肉瘤细胞143B的增殖和凋亡的影响以及可能的机制。方法体外培养人骨肉瘤细胞株143B;MTT比色法和克隆形成实验检测不同浓度DHA对骨肉瘤细胞存活与克隆形成能力的影响。Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态变化。构建β-Catenin荧光素酶报告基因(β-Catenin-Luc,p-Top)检测DHA作用143B后细胞内β-Catenin活性变化。不同浓度的DHA作用后,Western blot检测与细胞增殖(如PC-NA、Cyclin D1、c-Myc)、凋亡(如Bad、Bcl-2、Caspase-3)密切相关的标志物蛋白质表达变化。结果 DHA作用于143B细胞24 h后,MTT结果显示143B细胞的增殖活性受到明显抑制,且其克隆形成能力减弱(P<0.05),在DHA浓度达35μmol.L-1时,抑制效率最明显。Western blot结果显示PC-NA表达下调;而促凋亡蛋白Bad和Caspase-3表达上调,Bcl-2蛋白表达明显减弱。结论双氢青蒿素具有较明显的抑制人骨肉瘤细胞的增殖且促进其凋亡的作用,可能通过下调细胞增殖相关蛋白PCNA、Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bad和Caspase-3,启动凋亡程序,致143B细胞发生凋亡。
- 刘跃亮罗进勇张彦何通川曾照芳
- 关键词：双氢青蒿素人骨肉瘤细胞细胞增殖WNT信号通路Β-CATENIN
- 在体内外模拟的乳腺脂肪微环境中研究BMP9对乳腺癌细胞生长的影响被引量：1
- 2016年
- 骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins,BMP9)是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族的一员,具有多种生物学功能。本实验主要是从体内、外两个层面模拟的脂肪微环境中,研究BMP9对乳腺癌细胞生长的影响。将前脂肪细胞3T3-L1诱导为成熟脂肪细胞后,利用Transwell小室共培养技术,将其分别与MDA-MB-231细胞、感染腺病毒AdGFP的对照MDA-MB-231/AdGFP细胞、感染腺病毒AdBMP9的MDA-MB-231/AdBMP9细胞进行共培养。针对共培养体系中的肿瘤细胞,采用EdU实验检测增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期变化;Western blot检测cyclin D1、c-myc蛋白水平的变化。将乳腺癌细胞与脂肪细胞以1:5的比例混合后,注射到裸鼠皮下,监测瘤体的生长并绘制生长曲线;取离体肿瘤组织进行免疫组化染色,检测瘤体中ki67、cyclin D1和c-myc的表达情况。结果显示,显微镜下可以观察到诱导后的3T3-L1细胞出现明显脂滴,能被油红O染色,证明成熟脂肪细胞诱导成功;AT-PCR及Western blot证实BMP9过表达成功;BMP9可以抑制共培养体系中肿瘤细胞的增殖(p<0.05),使其周期阻滞在G_2/M期(p<0.05),并降低cyclin D1和c-myc的蛋白水平(p<0.05)。动物移植瘤实验发现,BMP9高表达实验组的瘤体明显小于空白组和载体感染对照组;瘤体免疫组化结果显示,实验组ki67、cyclin D1和c-myc的表达均明显下调。本研究证明在体内、外模拟的脂肪微环境中,BMP9可以抑制乳腺癌细胞的增殖,且这种作用可能是通过下调cyclin D1和c-myc来实现的。
- 王婷王晋蜀张志慧姜亚运夏菁苟理尧刘梦瑶张彦
- 关键词：乳腺肿瘤细胞生长
- 长链非编码RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定
- 2016年
- 目的制备shRNA干扰人长链非编码RNA Linc00461的慢病毒载体(shRNA-Linc00461),为进一步深入研究长链非编码RNA的功能奠定基础。方法利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计,根据小干扰RNA的设计原则,选取三对针对Linc00461特异性干扰引物送公司合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒p SIH1-H1,形成p SIH1-H1-shRNA-Linc00461质粒。用PCR及测序对其进行鉴定,之后与慢病毒包装质粒混匀,由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装,产生慢病毒shRNA-Linc00461,收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR鉴定重组慢病毒干扰效果。并选取干扰效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231细胞,运用MTT和流式细胞术检测细胞增殖和周期的改变。结果 SIH1-H1-shRNA Linc00461质粒经PCR验证和测序后,证实其构建成功。shRNA-Linc00461在HEK293T细胞中重组成慢病毒,并成功感染MDA-MB-231,感染效率约为70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后Linc00461的表达下调65.32%;感染shRNA-Linc00461第3天MTT结果显示:实验组吸光度值(0.232±0.032)明显低于实验对照组(0.398±0.037)。流式结果提示实验组G2M期细胞(47.55±5.063)%高于实验对照组(8.876±3.565)%。结论成功构建了shRNA-Linc00461慢病毒载体,并能有效抑制Linc00461表达,为深入研究人Linc00461基因功能奠定了基础。
- 孙笑笑王科张彦
- 关键词：RNA小分子干扰乳腺肿瘤慢病毒属
- 在体外模拟的骨微环境中下调BMP9对人乳腺癌SK-BR-3细胞增殖、迁移的影响及其可能机制被引量：1
- 2013年
- 探讨在体外模拟的乳腺癌骨转移微环境中,采用RNAi技术下调骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)基因对人乳腺癌SK-BR-3细胞增殖、迁移的影响及可能机制。用Transwell小室将空白组SK-BR-3细胞、感染腺病毒AdRFP的对照组SK-BR-3/RFP细胞、感染腺病毒AdsiBMP9的实验组SK-BR-3/siBMP9细胞分别与人骨髓基质HS-5细胞间接共培养后,MTT增殖实验、划痕愈合实验、Transwell迁移实验分别检测下调BMP9对SK-BR-3细胞增殖、迁移的影响;RT-PCR和Western blot法检测相关因子的变化。结果显示,在共培养体系中,SK-BR-3/siBMP9组的BMP9显著低于对照组(P<0.05);下调BMP9可有效促进SK-BR-3/siBMP9细胞增殖(P<0.05),SK-BR-3/siBMP9细胞的划痕愈合率、穿膜细胞数也明显升高(P<0.05);SK-BR-3/siBMP9组血管内皮细胞生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA和蛋白表达均显著上调(P<0.05),且Western blot结果显示p-AKT显著上调(P<0.05)。综上,在骨转移微环境中,干扰BMP9表达可促进人乳腺癌SK-BR-3细胞增殖及迁移,其作用机制可能与上调VEGF、CTGF表达有关,且这个过程可能涉及PI3K/AKT通路的激活。
- 陈莹莹王维刘月红万绍恒张志慧王婷王晋蜀张彦
- 关键词：乳腺肿瘤共培养
