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诱导多能干细胞(iPS)的诱导培养与鉴定被引量：8: 2010年; 通过外源转录调控因子的诱导,使成体细胞重编程为胚胎干细胞(ES细胞)样的多能细胞,这种细胞称为诱导多能干细胞(iPS细胞),这一方法被称为iPS技术。目前,iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用,建立了相应的iPS细胞系,并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处,但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究,对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。; 成德雷蕾卢智娟李珍王华岩; 关键词：诱导多能干细胞转录因子细胞重编程胚胎干细胞

PiggyBac转座子介导EGFP在猪体细胞和克隆胚胎中的表达: PiggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫Trichoplusia ni.的DNA转座子,因其可以携带长达14kb的DNA片段在多个物种的基因组上进行转座,所以可以作为良好的遗传操作工具。本实验以EGFP为标记基因,转座子...; 罗一博张力武美玲朱江刘忠华; 关键词：PIGGYBAC 猪体细胞克隆胚胎转基因; 文献传递

猪sall4b基因的克隆及表达分析: 2012年; sall4基因是sall基因家族的一个成员,在胚胎发育、器官形成和干细胞多能性的维持以及重建中都起到重要作用,有sall4a和sall4b两种剪切突变体类型。目前猪的sall4基因序列尚未获得。鉴于其在多能性细胞调控中的作用,对猪的sall4基因进行了克隆测序,并对其在各组织及胚胎中的表达进行了初步研究。通过5和3 RACE克隆得到猪sall4基因cDNA全长序列(2 372 bp),序列分析证明此基因编码的蛋白结构更接近于小鼠和人Sall4B亚型,同源性可达70%～80%,而与其他物种的Sall4A相比则缺少一段含锌指结构域的片段,同源性降至30%～55%。Real-time PCR证明猪sall4b基因广泛表达于猪的各种器官,其中除卵巢组织呈高量表达之外,脾、肺、心和睾丸表达量也相对较高;在早期胚胎发育过程中除4-细胞阶段相对表达量较低,其他阶段呈高量表达。免疫荧光跟踪Sall4在猪早期胚胎中的表达情况发现Sall4在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中,在囊胚阶段基因表达趋向于定位在内细胞团中。表达分析证明sall4b基因与多能性紧密相关,预示着猪sall4b基因将可能作为新的重编程因子用于诱导猪多能干细胞的体系中。; 张鑫淼韩小娇何文腾刘世超牟彦双胡魁刘忠华; 关键词：SALL4 基因克隆基因表达胚胎

慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转基因标记法研究猪嵌合体制作: 2012年; 目的:通过建立慢病毒载体感染猪胚胎体系实现胚胎标记,进而研究不同发育阶段猪孤雌胚胎之间的嵌合能力,为进一步研究猪早期胚胎发育以及细胞分化奠定基础。方法:首先,通过显微注射的方法把2×109I.U./ml、2×108I.U./ml和2×107I.U./ml三个梯度的表达绿色荧光的慢病毒载体分别注射到猪1-细胞胚胎和2-细胞胚胎的透明带下,进行胚胎的GFP转基因标记,在荧光显微镜下观察比较卵裂率、阳性胚胎率、囊胚率、阳性囊胚率和囊胚细胞数。然后,采用凹窝聚合法对同步发育胚胎在不同阶段(2-细胞,4-细胞,8-细胞)进行嵌合,2-细胞胚胎与不同发育阶段(2-细胞、4-细胞、8-细胞)胚胎进行嵌合以及2-细胞胚胎卵裂球互换制作嵌合体胚胎,发育到囊胚时在荧光显微镜下检测胚胎的嵌合状态。结果:2×109I.U./ml的慢病毒感染猪2-细胞胚胎组中,体外受精和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著高于其它滴度组(P<0.05),另外,慢病毒感染的两种胚胎与对照组对卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数三个指标没有显著影响(P>0.05)。2-细胞胚胎之间嵌合囊胚率和2-细胞卵裂球互换嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)显著高于2-细胞胚胎与4-细胞胚胎的嵌合率(18.60%,P<0.05),在同步发育胚胎中8-细胞胚胎之间的嵌合率(75.00%)高于4-细胞胚胎之间和2-细胞胚胎之间的嵌合率(65.00%、53.80%)。结论:2×109I.U./ml的慢病毒感染2-细胞期胚胎效率最高,另外,慢病毒感染对猪胚胎发育没有明显影响。8-细胞间的嵌合率比较高;发育同步胚胎间的嵌合率高于发育非同步胚胎间的嵌合率。; 石永乾何文腾周洋焦明霞解炳腾胡魁孔庆然刘忠华; 关键词：慢病毒载体绿色荧光蛋白聚合法嵌合

共表达外源OCT4/SOX2可激活人胚肾细胞中内源NANOG的表达被引量：1: 2011年; 自2006年诱导多能干细胞(iPS)技术诞生以来,采用病毒等载体进行的诱导方法已取得了成功.但是,其致瘤性的影响限制了病毒载体的推广与应用,而采用非病毒载体诱导iPS细胞成为研究的热点.本研究通过2个启动子的独立启动,构建了带有绿色荧光标记的OCT 4/SOX 2共表达诱导载体(pOct4/Sox2-EGFP).将该载体转染HEK 293FT细胞后,阳性克隆明显表达绿色荧光.并通过RT-PCR、免疫荧光等方法证明其中的转录因子OCT 4和SOX 2能在转染细胞中高效表达,同时诱导受体细胞中内源NANOG的转录表达.本研究说明,OCT 4/SOX 2共表达载体能激活NANOG基因的内源表达,暗示着非病毒不整合载体pOct4/Sox2-EGFP本身或与其它转录因子和小分子结合可用于诱导成体细胞的重编程.因此,本研究为下一步应用质粒载体诱导体细胞重编程为iPS细胞的研究奠定了工作基础.; 李珍珍成德高祎王华岩; 关键词：NANOG基因

猪胚胎干细胞研究进展被引量：2: 2010年; 胚胎干细胞是一类具有在体外无限自我复制和分化为体内任何种类细胞的多潜能细胞。目前,公认的胚胎干细胞全能性判断标准包括:体内及体外向三胚层细胞分化和二倍体嵌合后能形成生殖细胞。从1981年Kaufman等第一次分离小鼠胚胎干细胞至今,能满足这些标准的只有小鼠、大鼠和鸡的胚胎干细胞系。猪作为一种生理结构和器官的三维结构和人都比较相似的传统药物实验模型,其胚胎干细胞系的建立一直受到广泛的关注,但是迄今为止真正的猪胚胎干细胞系(即满足上述判定标准)还未被建立起来。本文将从多个方面阐述猪胚胎干细胞系的研究进展及亟待解决的问题。猪的全基因组序列已经测序完成,相信随着干细胞研究的深入开展,对维持多能性的转录因子和细胞信号通路认识的逐步加深,建立真正的猪胚胎干细胞系将成为可能。; 赵颖孔庆然刘忠华; 关键词：胚胎干细胞建系

猪bmp15基因报告载体的构建及其特异性被引量：2: 2014年; 为了研究骨形态发生蛋白15(bmp15)基因的表达和调控特性,通过克隆猪bmp15基因2.2 kb启动子片段,构建pBMP15-EGFP报告载体,实现监测干细胞向类卵母细胞分化的过程。以猪卵巢组织和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、成肌细胞(C2C12)、猪羊水干细胞(pAFSC)为材料,通过RT-PCR、免疫荧光、细胞转染、显微注射检测bmp15组织特异性表达,并且通过单层细胞诱导检测该基因体外示踪类卵母细胞获得过程的能力。RT-PCR结果显示bmp15在猪的卵巢组织中特异表达,在CHO中表达,而在C2C12和pAFSC中不表达。卵巢组织切片免疫荧光检测结果显示bmp15表达于卵泡发育的各个阶段。瞬时转染不同细胞发现启动子只在CHO中有活性,而在C2C12和pAFSC中均无活性。显微注射重组质粒片段结果显示增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein,EGFP)在卵母细胞体外成熟18 h启动表达,并能够持续至4-细胞期胚胎。单层细胞诱导结果显示诱导12 d的pAFSC出现携带EGFP的圆形细胞团。说明bmp15具有表达特异性和示踪干细胞诱导分化为类卵母细胞的潜能。; 秦明鸣魏江华俞晓丽张景龙刘晓鹏马晓玲王华岩; 关键词：BMP15 启动子基因表达

猪羊水干细胞特异向跳动心肌细胞诱导分化被引量：5: 2011年; 为了筛选并建立一种由猪羊水干细胞向心肌细胞分化的有效方法,以猪羊水干细胞为研究对象,以5-氮胞苷(5-aza)和维生素C(Vc)为诱导剂,对猪羊水干细胞形成的类胚体(EBs)进行诱导分化。应用免疫荧光、RT-PCR、透射电镜技术检测跳动细胞团中心肌特异性标记的表达情况。结果显示,在猪羊水干细胞形成的类胚体中加入心肌细胞诱导剂,10 d后即见到节律性跳动的细胞团,t检验发现0.1 mmol/L Vc加5μmol/L 5-aza联合诱导组的诱导效率最高,达33%。免疫荧光结果显示跳动心肌细胞团表达细胞骨架蛋白α-actin和肌钙蛋白Tnni3。RT-PCR检测跳动心肌细胞团,发现心肌细胞特异性标记分子TbX5、Gata4、α-MHC、Tnni3均呈阳性表达。借助透射电镜观察诱导后的跳动样细胞团,能清晰可见其中的肌丝、糖原粒、糖原池等结构。说明5-氮胞苷和维生素C可以促进猪羊水干细胞向心肌细胞的诱导分化。; 陈家欢魏育蕾彭莎王华岩; 关键词：心肌细胞 5-氮胞苷维生素C

The Defined siRNAs Suppress Nanog and Sox2 Expressions in Mouse ES Cells被引量：1: 2011年; Nanog,Oct4 and Sox2 are important transcription factors that are expressed in embryonic stem(ES) cells or embryonic carcinoma(EC) cells,but in most cases they are absent in somatic cells.These factors play a key role to maintain embryonic stem cell self-renew and pluripotency.Down-regulation of Nanog and Sox2 gene expression can change multiple gene expression patterns and signal transduction pathways,and will initiate ES cell differentiation.This study was designed to select the efficient small interfering RNA(siRNA) fragments that inhibit Nanog and Sox2 gene expression in mouse J1 ES cells and P19 EC cells.Among synthesized siRNAs we screened out the siRNA N301 for Nanog and siRNA S720 for Sox2,which not only down-regulated of Nanog and Sox2 gene expression,but also interfered embryoid bodies formation.Our study provided the defined siRNA fragments that could be used to investigate the epigenetic function of Nanog and Sox2 genes.; LEI Lei DOU Lin WANG Hua-yan; 关键词：NANOG基因 ES细胞

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国家重点基础研究发展计划(2009CB941002)

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