国家自然科学基金(31070786)
- 作品数：4 被引量：8H指数：2
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 髓系触发受体-1在柯萨奇病毒B3导致的炎症反应及心肌细胞损伤中作用的实验研究被引量：3
- 2012年
- 目的通过体外观测柯萨奇病毒B3（CVB3）感染后髓系触发受体-1（TREM-1）在巨噬细胞中的表达，进一步探讨病毒性心肌炎炎症损伤的作用机制。方法CVB3感染巨噬细胞后，按感染时间进行分组，检测各组TREM-1mRNA的转录情况（具体分为0h、1h、4h、8h和12h组），免疫印迹法检测TREM-1及其下游分子DAP-12蛋白的表达（具体分为0h、16h、24h和48h组），用LP-17阻断TREM-1作为干预组，与单纯CVB3感染组（24h）和不感染CVB3的对照组比较，酶联免疫吸附法检测巨噬细胞分泌蛋白肿瘤坏死因子α（TNF—α）的量，用CCK8和AnnexinV-FITC观察与巨噬细胞上清共培养后的心肌细胞的活力和凋亡。结果CVB3感染后4h组TREM-1mRNA表达量高于0h组（但差异无统计学意义），8h组和12h组则显著高于0h组（P均〈0．01），16h组和24h组TREM-1蛋白表达水平显著高于0h组（P均〈0．01）。CVB3感染24h组和48h组TREM-1的下游信号分子DAP-12的蛋白表达也显著高于0h组（P均〈0．01）。LP-17干预组巨噬细胞分泌的TNF-α的量明显少于CVB3感染组（24h）（P〈0．01）。LP-17干预组心肌细胞的活力显著高于CVB3感染组（24h）（P〈0．01），细胞凋亡少于CVB3感染组（24h）（P〈0．01）。结论CVB5通过诱导巨噬细胞中TREM一1的表达产生过度的炎症反应，进一步引发心肌细胞的间接损伤是急性病毒性心肌炎的发病机制之一。
- 张娴王兴冈解玉泉谢烨卿刘旭杰李明辉虞勇郭棋陈瑞珍
- 关键词：心肌炎巨噬细胞
- miR21对心脏微血管内皮细胞PDCD4/AP1通路的调节作用被引量：2
- 2015年
- 目的探讨柯萨奇B3病毒(CVB3)感染离体培养的大鼠心脏微血管内皮细胞(CMVECs)后,miR-21对PDCD4和转录因子AP1构成的调节通路的影响。方法 (1)CVB3感染CMVECs 48h,实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-21表达;(2)CVB3病毒感染CMVECs48h后,Western Blot法检测各组细胞中PDCD4蛋白表达;(3)CMVECs瞬时转染miR-21模拟物48h后,Western Blot法检测各组细胞中PDCD4蛋白表达;(4)双荧光素酶报告基因法研究miR-21与PDCD4基因靶向结合位点;(5)CM V ECs细胞共转染PDCD4和AP1-Luc质粒,检测AP1-Luc荧光素酶活性以观察PDCD4基因对AP1活性的影响;(6)提取各组细胞核蛋白,电泳迁移率改变实验(EMSA实验)检测AP1和DNA的结合活性。结果 (1)CMVECs感染CVB3病毒48小时后,与对照组比较,病毒感染组miR-21表达上调4.12倍;(2)CMVECs感染CVB3病毒48小时后,与对照组比较,病毒感染组PDCD4蛋白表达明显下调;(3)CM V ECs过表达miR-21后PDCD4蛋白表达下调;(4)CM V ECs过表达miR-21后显著抑制野生型PDCD4基因3’UTR活性,而对突变型3’UTR活性无影响;(5)CMVECs过表达PDCD4基因48h后AP1-Luc荧光素酶活性与对照组相比明显下调;CMVECs过表达miR-21 48h后AP1-Luc荧光素酶活性与对照组相比显著上调;(6)EMSA实验结果显示CMVECs过表达PDCD4 48h后AP1与DNA结合活性明显下调,过表达miR-21后AP1与DNA结合活性明显上调。结论 CVB3感染CMVECs后上调miRNA-21表达。miR-21通过与靶基因PDCD4的3’非翻译区(3’UTR)靶向结合抑制PDCD4表达、上调A P1活性及A P1与DNA结合活性。
- 虞勇虞莹刘桂剑王兴岗郭棋邹云增陈瑞珍
- 关键词：MIR-21柯萨奇B3病毒心脏微血管内皮细胞PDCD4
- microRNA在柯萨奇B3病毒诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡中的差异表达被引量：3
- 2014年
- 目的本研究通过体外培养心脏微血管内皮细胞(CMVECs),经柯萨奇B3病毒(CVB3)感染后,利用miRNA寡核苷酸基因芯片技术筛选差异表达的miRNAs,进一步探讨miRNA在CVB3诱导CMVECs凋亡中的潜在作用机制。方法原代分离培养大鼠CMVECs细胞,以100TCID50CVB3病毒感染48 h后检测Caspase-3活性和细胞凋亡;提取CMVECs细胞RNA,用Agilent大鼠miRNA寡核苷酸基因芯片进行检测,并通过TargetScan、miranda、mirbase和mirdb数据库选取出差异表达明显并与心血管疾病相关的miRNA,经qPCR对其进行验证,通过生物信息学分析预测其调控靶基因;合成miRNA21 mimics转染CMVECs细胞,同时合成miRNA21 inhibitor,与CVB3共转染CMVECs细胞,检测各组细胞Caspase-3活性变化和细胞凋亡。结果 CVB3感染CMVECs细胞48 h后与正常对照组比较Caspase-3活性显著上调(P<0.01),细胞凋亡明显增加;通过基因芯片检测及生物信息学分析后发现,与心血管系统疾病密切相关的miRNA为miRNA21,经qPCR验证结果一致,预测其靶基因为PDCD4;miRNA21mimics转染CMVECs细胞后与正常对照组相比Caspase-3活性显著上调,细胞凋亡增加(P<0.05);而miRNA21 inhibitor与CVB3共转染CMVECs细胞后与CVB3感染组相比Caspase-3活性显著下调,细胞凋亡明显减少(P<0.05)。结论 miRNA21在CVB3感染的CMVECs细胞中的表达有显著变化,并与CMVECs细胞凋亡密切相关,提示miRNA21在CVB3诱导的病毒性心肌炎发病过程中可能起着重要作用。
- 虞勇虞莹王兴冈邹云增陈瑞珍
- 关键词：柯萨奇B3病毒心脏微血管内皮细胞
- 钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb／C小鼠的繁育及鉴定
- 2016年
- 目的:建立钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因过表达Balb/C小鼠的培育方法,并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法:将雄性C57BL/6-CAST^(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交,将雄性CAST^(+/-)杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交,连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织,采用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR法扩增CAST基因片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST^(-/-)小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果:C57BL/6-CAST^(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要,且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST^(-/-)基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论:成功建立Balb/CCAST基因过表达小鼠,为后续研究奠定了基础;碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效,值得推广。
- 虞勇李明辉刘桂剑李冰玉邹云增陈瑞珍
- 关键词：钙蛋白酶钙蛋白酶抑制蛋白柯萨奇B3病毒基因型鉴定
