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粉尘螨体壁及血体腔超微结构观察被引量：1: 2014年; 目的本研究主要使用透射电镜观察粉尘螨(Dermatophagoides farinae)体壁及血体腔超微结构。方法取成年粉尘螨20只,先后用2.5%戊二醛及1%锇酸行前后固定,经脱水、包埋、超薄切片、正染色后行透射电镜观察。结果粉尘螨的表皮由上表皮和前表皮构成,其中上表皮进一步分为表皮质层、蜡层和黏质层,前表皮可分为内表皮和外表皮。前表皮结构分层明显,其内可见许多孔道和薄片。粉尘螨血体腔由体壁围绕而成,各组织器官浸浴在血淋巴中,血淋巴内可见大量线粒体、液泡、糖原颗粒以及少量细菌、吞噬细胞等。结论粉尘螨体壁及血体腔超微结构的观察为其形态学研究提供更全面的实验依据。; 王月明吴琳吴莹莹李盟杨利桃黄礼年孙新刘志刚; 关键词：粉尘螨体壁超微结构

尘螨肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118的表达及纯化: 2014年; 目的研究尘螨肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118的表达和纯化,为研究其在尘螨疫苗免疫治疗中的作用奠定基础。方法采用生物信息学方法,根据GenBank中Hypothetical protein CE2118蛋白的基因序列,将其中稀有密码子改造为大肠杆菌常用密码子并进行二级结构优化,合成Hypothetical protein CE2118基因,构建原核表达载体pGEX6P-1-hypothetical protein CE2118并经酶切鉴定,在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用GST亲和层析纯化柱纯化。结果经密码子改造和二级结构优化后Hypothetical protein CE2118基因长度为588bp,其编码蛋白理论分子量为21kDa。重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,该基因经IPTG诱导在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中得到高效的可溶性表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21kDa,其单一蛋白纯度达95%以上。结论本研究成功构建了Hypothetical protein CE2118基因的pGEX6P-1原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白为进一步研究肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118在尘螨疫苗免疫治中的作用机理奠定基础。; 杨小猛袁谢芳陈涛杨平常刘志刚; 关键词：尘螨肠道微生物 PROTEIN

粉尘螨Der f4基因的克隆和蛋白分子特征分析被引量：2: 2014年; 从深圳地区采集粉尘螨纯培养,提取总RNA,根据香港中文大学合成的尘螨基因序列并设计的引物,RT-PCR扩增出Der f4基因,克隆到pUC57载体后测序和进行生物信息学分析.将该目的基因克隆到pET-28a表达载体上得到重组质粒pET-28a-Der f4.用生物软件分析尘螨变应原Der f4序列.RT-PCR获得目的基因Der f4 cDNA全长为1 593 bp.推测编码蛋白由526个氨基酸组成,生物信息学分析表明,Der f4具有多种磷酸化位点,含有信号肽,为疏水性蛋白,包含淀粉酶抑制剂功能结构域.获得Der f4基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有淀粉酶抑制剂活性.; 万倩陈献雄孙新钟政荣刘志刚; 关键词：粉尘螨生物信息学克隆

粉尘螨生殖系统超微结构的透射电镜观察被引量：2: 2013年; 本研究主要采用透射电镜观察粉尘螨Dermatophagoides farinae(Hughes)生殖系统超微结构。粉尘螨雄性生殖系统是由精巢、输精管、附腺、射精管、交配器官及附属交配器官组成。精巢内可同时有精子发育各阶段的细胞。精子无核膜、核染色质聚集成束、线粒体缺乏典型的嵴、胞质内有平行排列的电子致密薄片等为其特征性结构。雌性生殖系统由交合囊、交合囊管、储精囊、囊导管、卵巢、输卵管、子宫及产卵管构成。卵巢内可见含多个细胞核的中央细胞,其周为卵母细胞等生殖细胞。该研究丰富了对粉尘螨生殖系统结构的认识。; 王月明刘晓宇黄礼年孙新刘志刚; 关键词：粉尘螨生殖系统卵巢超微结构透射电镜

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化被引量：2: 2014年; 根据GenBank中NDP kinase的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成NDP kinase基因,构建原核表达载体pET28a-NDP kinase并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后NDP kinase基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌BL21(DE3)中该基因经IPTG诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶(NDP kinase)基因的pET28a原核重组质粒,为进一步研究NDP kinase在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.; 杨小猛王俊轶陈涛刘志刚杨平常; 关键词：尘螨肠道微生物

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定被引量：1: 2013年; 目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。; 袁小惠高安健邬玉兰刘志刚; 关键词：粉尘螨 F5 蛋白表达纯化免疫印迹

粉尘螨消化系统超微结构观察: 2013年; 粉尘螨50只经2.5%戊二醛前固定后,使用1%锇酸后固定,经乙醇梯度脱水、包埋、超薄切片、正染色后,透射电镜观察其超微结构。粉尘螨消化系统由前、中和后肠三部分构成,其中中肠进一步分为前中肠和后中肠。前肠和后肠内覆表皮,中肠内覆微绒毛。此外,前中肠可见多种肠壁上皮细胞,细胞顶端微绒毛较短;后中肠微绒毛极长,肠腔可见围食膜包绕的食物团块,团块内含大量细菌。粉尘螨消化系统各肠道的细胞构成不同,尤其中肠肠壁上皮细胞的形态、种类多样,中肠为粉尘螨消化吸收的主要部位。; 王月明刘晓宇蒋聪利黄礼年孙新刘志刚; 关键词：粉尘螨超微结构

粉尘螨Der f15的基因克隆与其表达载体的构建被引量：4: 2013年; 先挑取纯培养的粉尘螨,提取总的RNA,后采用RT-PCR方法进行反转录出cDNA.由cDNA提取出目的基因进行片段扩增,产物连接入T载体(pMD18-T).经扩增后,用EcoR I和Xho I双酶切,将目的基因分别连接到pET28和pET32的表达载体上,得到重组质粒pET28和pET32,即粉尘螨的基因克隆与表达载体构建成功.; 李钟鸣邬玉兰刘志刚; 关键词：粉尘螨克隆

粉尘螨Derf14基因克隆与分子特征的分析被引量：1: 2015年; 从纯培养的粉尘螨中,根据本课题组前期合成的尘螨基因序列,将扩增的Derf14分别克隆到pUC57载体中,经扩增后用SmaI双酶切将目的片段连接到pET-28a表达载体上得到重组质粒pET28aDerf14.在线软件ExPaSy,NCBI网站对测序结果进行分析.分析结果表明：获得的目的基因Derf14cDNA全长为5013bp.编码蛋白由1666个氨基酸组成.粉尘螨Derf14与屋尘螨序列比对同源性达95%,信号肽序列存在1-18个氨基酸,二级结构是由a螺旋（35.83%）﹑延伸链（17.17%）﹑无规则区（47%）组成.目的蛋白是一种卵黄蛋白原.; 万倩钟政荣刘志刚; 关键词：克隆生物信息学进化树

粉尘螨第十六类变应原的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定被引量：2: 2013年; 目的获得大量具有良好IgE结合活性的粉尘螨第十六类变应原(Der f16)的重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知Der f16基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Der f16基因片段,产物连入pMD32-T载体中。扩增后,利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切将目的基因片段连接到pET32a表达载体上,转化到大肠杆菌(E.coli BL21)中经IPTG诱导表达。表达载体经亲和层析纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western bolt检测变应原免疫学活性。结果以粉尘螨总RNA为模板成功克隆出Der f16基因,与数据库中Der f16基因同源性为100%;经IPTG诱导后,大肠杆菌大量表达Der f16蛋白,所获得的重组蛋白分子质量为73ku,上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物。重组Der f16能够与螨过敏患者血清中的IgE反应,而不与健康者血清中的IgE反应。结论成功构建了Der f16的原核表达载体,并高效表达和纯化出具有免疫原性的Der f16重组蛋白。; 李维中王月明吴莹莹邬玉兰刘志刚; 关键词：粉尘螨克隆纯化

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深圳市科技计划项目(JCYJ20120613100657482)

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