目的克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达。方法分离屋尘螨总RNA,根据Gen Bank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+),将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET-28a(+)-Der f 1,Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 1编码基因与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸222个。屋尘螨和粉尘螨1类变应原氨基酸序列相似率为60%,而粉尘螨与梅氏嗜霉螨1类变应原相似率为85%,分子进化分析亦提示粉尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近。推测所获rDer p 1二级结构中,α螺旋占33.78%,延伸链占21.62%,随机线圈占44.59%。结论尘螨变应原Der p 1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。序列分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。
目的原核表达尘螨主要变应原Der p 2。方法分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 2核酸序列设计引物用RT-PCR扩增Der p 2编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a(+),将表达质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET28a(+)-Derp2,SDS-PAGE和Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 2编码基因与参考序列同源性达99.54%,推测其编码氨基酸130个,相对分子质量约为14348.5。结论尘螨变应原Der p 2原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。
