国家自然科学基金(30760276)
- 作品数：9 被引量：28H指数：4
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- 间充质干细胞介导“酶一前药基因”CYPIA2靶向抗肿瘤效应研究被引量：1
- 2009年
- 目的将人细胞色素P4501A2（CYP1A2）基因转染骨髓间充质干细胞（BMSC），检测转基因BMSC协同化疗前药达卡巴嗪（DTIC）对人恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞的靶向促凋亡作用，为以间充质干细胞为载体的“基因介导的酶-前药双靶向抗肿瘤策略”提供体外实验依据。方法从人肝细胞中克隆CYP1A2基因，构建真核表达载体，分离、鉴定并培养BMSC，脂质体法将CYP1A2基因导入BMSC和Raji细胞中，RT—PCR和Western blot法检测CYP1A2基因的表达，Trans well法检测BMSC的肿瘤靶向性，MTF法检测转基因Raji细胞对DTIC敏感性的改变，Annexin V／PI染色标记法检测转基因BMSC联合DTIC诱导Raji细胞凋亡的作用。结果成功克隆CYP1A2基因并将构建的真核表达载体转染BMSC和Raji细胞，流式细胞术检测体外诱导分化结果符合BMSC特性，RT-PCR和Westernblot检测到转基因细胞中CYP1A2表达，Transwell迁移实验证实BMSC有肿瘤趋向性，MTT法检测显示DTIC呈剂量依赖性抑制转CYPIA2基因的Raji细胞生长，而转CYP1A2基因的BMSC细胞对DTIC相对耐受（IC50值分别为1．67mmol／L和7．53mmol／L，P〈0．01）。AnnexinV／PI染色法显示CYP1A2能够使细胞在体外代谢DTIC，产生细胞毒效应使肿瘤细胞凋亡，而且具有旁观者效应。结论CYP1A2可使细胞在体外代谢DTIC产生细胞毒效应。以BMSC为载体的CYP1A2-DTIC酶-前药系统可发挥双靶向抗肿瘤作用，在体外诱导人恶性淋巴瘤细胞凋亡。
- 杨远王季石张巍袁军杨明方琴
- 关键词：基因CYP1A2达卡巴嗪
- 逆转录病毒介导的HO-1基因在尼洛替尼诱导K562／A02耐药细胞凋亡中的作用被引量：4
- 2012年
- 目的研究逆转录病毒介导的血红素加氧酶-1（HO-1）基因在尼洛替尼（Nilotinib，AMN107）诱导慢性髓性白血病（CML）耐药细胞凋亡中的作用。方法制备高病毒滴度的逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-HO-1，建立稳定转染HO-1基因的K562／A02细胞。采用RT-PCR鉴定K562／A02细胞中HO-1基因的表达。liT-PCR和Westernblot法检测AMN107作用24h后K562／A02细胞中HO-1mRNA和蛋白的表达，采用MTT法观察细胞增殖变化，通过实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法检测bcr-abl融合基因的表达，通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布。结果成功构建重组逆转录病毒载体，并建立稳定转染HO-1基因的K562／A02细胞系；证实转基因组细胞HO-1mRNA显著表达。AMN107作用3组细胞后，转基因组细胞HO-1mRNA和蛋白的表达明显高于转空载体组和未转染组，差异有统计学意义（P〈0．05）；MTY法检测显示AMN107处理后细胞增殖受抑，而转基因组细胞存活率明显高于转空载体组和未转染组，差异有统计学意义（P〈0．05）；RQ-PCR法检测结果显示，10μmol／LAMN107抑制bcr-abl基因的表达，但转基因组的bcr-abl基因表达水平（Ct值18．15±0．18）高于转空载体组（20．32±0．20）和未转染组（20．51±0．21），差异有统计学意义（P〈0．05）；流式细胞术检测结果显示10ixmol／LAMN107作用24h后，转基因组、转空载体组、未转染组细胞凋亡率分别为（17．26±0．23）％、（39．47±0．17）％、（41．84±0．09）％，未加药转基因组、未加药未转染组细胞凋亡率分别为（3．74±0．03）％、（5．91±0．08）％；细胞周期分析结果显示经AMN107处理后，G0／G1期和S期细胞明显减少，细胞阻滞在G2／M期，而转基因细胞组细胞周期改变不如转空载体组、未转染组明显。结论AMN107可抑制CML耐药细胞增殖且诱导细胞凋亡，HO-1基因在CML耐药细胞凋亡过程中起保护作�
- 陈珵王季石秦东杨远于艳艳方琴
- 关键词：逆转录病毒载体尼洛替尼K562/A02细胞
- SD大鼠脂肪干细胞体外分离培养及造血因子表达情况的研究被引量：1
- 2009年
- 目的建立一种体外分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,观察其增殖的规律,并探讨其造血因子的分泌情况。方法无菌技术下切取双侧腹股沟皮下脂肪垫,加入0.1%Ⅰ-型胶原酶消化获取细胞,接种入含10%胎牛血清的DMEM培养液,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并用流式细胞学鉴定CD90、CD34、CD44、CD45、CDl06和CDllb的表达,ELISA法检测造血因子的表达,并作统计学分析。结果原代培养显示培养的脂肪干细胞24 h左右开始贴壁,8 d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,从第3代开始细胞稳定增殖,15代以前具有活跃的增殖能力。流式细胞学鉴定显示CD44、CD90、CDl06为阳性表达,CD34、CD45、和CDllb为阴性表达,脂肪干细胞能持续的表达G-CSF、GM-CSF、M-CSF、SCF、IL-6,统计学分析提示各代细胞因子的分泌呈缓慢下降趋势。结论成功地建立了一种分离培养大鼠脂肪干细胞的方法,其生长稳定、增殖较快,可以作为组织工程的种子细胞,其稳定的表达多种造血因子,找到了一条促进造血干细胞增殖的新途径。
- 李大鹏王季石
- 关键词：脂肪干细胞细胞培养造血因子
- 去甲氧柔红霉素治疗急性髓系白血病的临床观察被引量：5
- 2010年
- 目的:观察去甲氧柔红霉素(IDA)与柔红霉素(DNR)、米托蒽醌(MTN)、吡柔比星(THP)治疗急性髓系白血病的疗效和毒副反应。方法:选择我院2005年4月～2010年4月住院的62例急性髓系白血病患者,随机分为2组,治疗组30例采用IDA+阿糖胞苷(Ara-C)治疗,对照组32例采用DNR(或MTN、THP)+Ara-C治疗。结果:治疗组和对照组完全缓解率(CR)分别为80.0%和43.8%,总有效率(RR)分别为93.3%和68.8%,临床严重感染率分别为36.7%和34.4%。2组CR和RR比较,差异有统计学意义(P<0.05),但2组的严重感染率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:以IDA组成的联合化疗方案治疗急性髓系白血病疗效较好。
- 卢英豪王季石方琴曾小箐何玲沈如刚孙志强张燕
- 关键词：去甲氧柔红霉素柔红霉素米托蒽醌吡柔比星急性髓系白血病
- 细胞色素氧化酶P450 3A4基因联合环磷酰胺的体外抗肿瘤效应被引量：1
- 2009年
- 目的克隆细胞色素氧化酶P4503A4(CYP3A4)基因,构建真核表达质粒并导入K562细胞进行表达,研究CYP3A4联合环磷酰胺(CPA)的体外抗肿瘤效应。方法利用RT-PCR从人肝细胞中克隆CYP3A4基因,构建重组真核表达载体。脂质体法导入K562细胞,RT-PCR和Western blot检测CYP3A4基因在K562细胞中的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。MTT法检测CYP3A4联合CPA对肿瘤细胞的抑制作用。结果成功克隆CYP3A4基因并构建了真核表达质粒pcDNA3.1/myc-HisA(+)-CYP3A4。RT-PCR和Western blot分别显示转基因组的CYP3A4 mRNA和蛋白质表达水平均显著高于转空载体组和对照组。MTT示转基因组IC50值为1.09016mmol/L,明显低于转空载体组和对照组。酶诱导剂和抑制剂分别能够减低和增高转基因组IC50。结论CYP3A4体外具有联合CPA的抗肿瘤作用,这种作用能够被CYP3A4相应的诱导剂和抑制剂增强或减低。
- 张巍王季石杨远方琴
- 关键词：环磷酰胺肿瘤治疗基因转染
- 含CYP2E1基因的重组腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞联合达卡巴嗪的抗肿瘤效应被引量：1
- 2010年
- 目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1（CYP2E1）基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒（1.2×1012 pfu/ml）.分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞（BMSC）.用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白（EGFP）、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐（MTT）和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪（DTIC）的抗肿瘤效应（实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1＋A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC）.结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1＋A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1＋A375组药物半数抑制量（IC50）值为（0.17±0.13）mmol/L,其对照组为（0.65±0.20）mmol/L,二者差异有统计学意义（P＜0.01）,可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1＋A375组细胞凋亡率明显高于其对照组（26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01）.结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.
- 王季石胡晓彦张巍袁军杨远方琴
- 关键词：细胞色素P-450CYP2E1达卡巴嗪
- HO-1基因表达对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病细胞增殖的影响被引量：3
- 2011年
- 目的通过氯高血红素（Heroin）诱导伊马替尼耐药慢性髓系白血病（CML）细胞株K562／A02．IM中血红素加氧酶-1（HO-1）基因表达，探讨HO-1基因对伊马替尼耐药CML细胞增殖的影响，为治疗CML多药耐药及新药的开发提供思路和实验依据。方法采用RT—PCR法检测20例CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞中HO-1基因的表达，半定量RT—PCR法和Westernblot法分别检测不同剂量Hemin处理K562／A02-IM细胞不同时间后HO-1的表达，通过AnnexinV／H双染色法检测细胞凋亡情况，采用MTT法检测Hemin诱导及锌原卟啉抑制HO-1表达与细胞存活率的关系。结果RT—PCR结果显示耐药患者骨髓细胞中HO-1基因阳性表达，半定量RT—PCR和Westernblot法显示，不同浓度的Heroin（0、10、20及40μmol／L）处理K562／AO2-IM细胞16h后，HO-1的表达量随Heroin浓度的升高而增加，存在剂量依赖关系，而20μmol／LHeroin分别处理K562／AO2-IM细胞0、8、16、24h后，HO-1的表达量在处理16h组最高。AnnexinV／PI法检测显示，0、10、20及40pmlol／LHemin作用于K562／AO2-IM细胞16h后细胞凋亡率分别为（17．61±0．01）％、（12．13±0．11）％、（7．94±0．03）％和（4．62±0．15）％，其抗凋亡的作用呈剂量依赖性；20pmol／LHemin作用K562／A02-IM细胞8、16及24h的细胞凋亡率分别为（14．72±0．05）％、（8．15±0．07）％和（16．37±0．13）％。MTT法检测显示与对照组相比，Hemin诱导K562／AO2-IM细胞HO-1基因表达促进了细胞的增殖，且作用存在剂量依赖关系；而锌原卟啉抑制HO-1的表达，促进了细胞的凋亡（P〈0．05）。结论CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞HO-1基因阳性表达，HO-1是一种可诱导表达型基因，具有抗细胞凋亡及促进细胞增殖的作用，抑制HO-1表达可能成为治疗CML耐药的新方法。
- 王季石柴柏胜方琴何颖颖陈珵杨畅
- 关键词：血红素加氧酶-1伊马替尼耐药
- 141例慢性骨髓增生性疾病中JAK2基因V617F点突变的研究被引量：8
- 2009年
- 目的:研究分子遗传学标记JAK2V617F突变在141例慢性骨髓增殖性疾病(cMPD)患者中发生率、突变类型及其与血液学特征的相关性。方法:应用等位基因特异性PCR(AS-PCR)技术进行JAK2V617F点突变的检测,采用PCR-限制性片断长度多态性(RFLP)方法检测JAK2V617F(+)者的突变类型,然后DNA测序验证。结合临床资料进一步分析。结果:经AS-PCR发现141例cMPD中有73例为JAK2V617F突变阳性样本,其中21例BCR-ABL阳性的CML中未发现突变样本。JAK2V617F(+)的病例中19例为纯和型突变,54例为杂和型突变。经酶切及测序验证结果相符。结合临床资料进行分析,JAK2V617F突变阳性患者外周血细胞分析中白细胞数和血红蛋白的量较野生型高,而血小板计数较野生型差异无统计学意义。JAK2V617F纯和型突变患者外周血细胞计数中血红蛋白的量较杂合型高,而血小板计数较杂合型低,白细胞计数差异无统计学意义。结论:JAK2V617F点突变可以作为BCR-ABL阴性的MPD诊断的一个参考依据。在突变类型中纯和型突变较为少见。突变类型对血液学特征有一定的影响。
- 梅丽娜王季石卢英豪李建勇
- 关键词：骨髓增殖性疾病JAK2V617F酶切
