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国家自然科学基金(30400558): 作品数：10 被引量：15H指数：2; 相关作者：熊冬生杨纯正高瀛岱王金宏杨铭更多>>; 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院中国医学科学院中国协和医科大学天津市第一中心医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金天津市科技发展战略研究计划项目天津市科技攻关计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

钙调素拮抗剂O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺增强阿霉素杀伤MCF-7/ADR细胞的机制研究被引量：1: 2010年; 目的研究钙调素拮抗剂0-4-乙氧基-丁基-小檗胺(EBB)增强阿霉素诱导乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR细胞的杀伤作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、EBB单独及联合用药对阿霉素杀伤乳腺癌多药耐药细胞系(MCF-7/ADR)及其亲代细胞系(MCF-7)的作用的IC50值,用不同浓度EBB处理MCF-7/ADR细胞后用FACS法分析EBB对阿霉素诱导细胞凋亡及对mdr1mRNA和P-gp蛋白水平表达的影响,通过激光共聚焦显微镜观察EBB处理前后及用EBB预处理24和48h后MCF-7/ADR和MCF-7细胞内阿霉素浓度的改变。结果MTT结果显示EBB对MCF-7和MCF-7/ADR都具有抗肿瘤活性;EBB还能协同提高阿霉素的细胞毒作用,MCF-7组两药相互作用指数(CDI)值为0.73,MCF-7/ADR组CDI值为0.49,其对耐药细胞的协同作用更为明显。随EBB剂量增加,低剂量阿霉素诱导MCF-7/ADR细胞凋亡增加而且P-gp蛋白表达水平逐渐下降,细胞内阿霉素浓度逐渐提高,而且用EBB预处理MCF-7/ADR细胞24和48h后细胞内阿霉素和罗丹明浓度也逐渐提高。结论EBB是有效的肿瘤细胞化疗药物,它不但能直接抑制P-gp功能还具有下调P-gp蛋白表达的作用,从而有效逆转MCF-7/ADR细胞的耐药现象,协同增强化疗药物对耐药细胞的杀伤作用。; 赵英新刘荣范冬梅任思楣李崴师锐赞张砚君杨铭; 关键词：MDR1基因 P-GP 阿霉素共聚焦激光扫描显微镜

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测: 2008年; 目的制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。方法采用常规免疫学方法制备抗抗CD3ScFv单克隆体并制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]的分离纯化。采用FACS法测定分别经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱及抗E-tag亲和层析柱纯化的抗CD3ScFv蛋白和Diabody[CD3×Pgp]对K562/A02和Jurkat细胞特异结合活性。采用间接ELISA法进行抗抗CD3ScFv抗体特异性结合活性的检测。结果抗抗CD3ScFV单克隆抗体能特异性地与抗CD3ScFv蛋白结合而不与血清发生反应。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱和经抗E-tag亲和层析柱纯化后的抗CD3ScFv蛋白均能与Jurkat细胞特异结合。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱纯化的去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合的阳性率分别为89.87%和83.95%;与其亲代抗体竞争结合K562/A02和Jurkat细胞后,结合率分别下降为56.30%和43.78%。结论制备了抗抗CD3单克隆抗体和亲和层析柱,可用于抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。; 邵晓枫高灜岱刘娟妮王金宏许元富范冬梅杨纯正熊冬生; 关键词：单克隆抗体

抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体在小鼠体内性质的研究被引量：2: 2006年; 目的:研究抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体的体内作用。方法:125I标记抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体采用氯胺T法,并采用昆明鼠和人K562耐药裸鼠移植瘤模型分别测定该微型双功能抗体在小鼠体内的药代动力学和体内组织分布;采用人K562耐药及敏感裸鼠移植瘤模型测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性及其不良反应。结果:抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体在昆明鼠体内的半衰期为2h;尾静脉注射抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体6h后,其在肿瘤部位的分布高于其他组织,在12h和24h时,其在肿瘤与血液分布的比率分别为2.69和8.09;抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体能介导人T细胞有效杀伤表达Pgp抗原的K562耐药细胞。结论:抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体能在裸鼠皮下人白血病细胞移植瘤部位富集,并能有效地抑制耐药白血病移植瘤的生长,无明显的不良反应。; 秦岚赵艳津高瀛岱杨铭苏晔吕晶丽邵梦麟熊冬生杨纯正; 关键词：P糖蛋白小鼠

免疫亲和层析法纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体被引量：1: 2008年; 目的:制备可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱。方法:纯化的抗抗CD3ScFv单克隆抗体与预活化的Sepharose4B偶联制成免疫亲和层析柱,采用自制的免疫亲和层析柱纯化由摇瓶发酵获得的抗Pgp/抗CD3双功能抗体,采用间接免疫荧光法测定抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合活性。结果:成功地制备了可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱,采用此柱纯化的抗体与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合的活性与带有E-tag纯化标志的抗体基本一致。结论:此介质可以替代价格高昂的E-tag亲和层析介质在纯化Pgp/抗CD3双特异双功能抗体中的应用,同时还可以避免由于E-tag纯化标志而带来的免疫原性问题,此项研究工作为抗Pgp/抗CD3双功能抗体将来在临床应用奠定了基础。; 王金宏刘娟妮高瀛岱邵晓枫熊冬生杨纯正

抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体的高密度发酵与纯化被引量：2: 2008年; 在发酵罐上采用高密度发酵的方法对抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体工程菌进行了培养,其发酵结果是每升发酵液的湿菌菌重150g,OD550值达121;以免疫亲和层析的方法纯化抗CD3ScFv/抗PgPScFv双功能抗体,经计算抗体产量可达146.6mg/L;间接免疫荧光测定结果经流式细胞仪分析计算表明,抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合。; 王金宏刘娟妮纪庆高瀛岱熊冬生杨纯正; 关键词：抗CD3 高密度发酵

CDK9/Cyclin T(P-TEFb)及其生物学功能被引量：3: 2007年; 细胞周期依赖性激酶（cyclin-dependentkinases，CDKs）家族目前已经发现9个成员（CDK1～CDK9），根据其功能分为两大类：控制细胞周期的CDKs和控制细胞转录的CDKs。CDK9即属于后者。CDK9是正性转录延长因子b（positive transcription elongation factorb，P-TEFb）中的催化亚基成分，通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）和一些负性转录延长因子从而使转录从起始部位得以延伸。cdk9／cyclin T的异常表达与很多疾病的发生有密切关系。Cdk9／CyclinT将给艾滋病和肿瘤等疾病的治疗提供颇有应用前景的作用靶点。; 曹华高瀛岱

二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体的构建、表达及活性测定被引量：1: 2009年; 向抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(Diabody)中引入二硫键,使diabody两条链以共价键交联,增强其稳定性。用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法,将抗CD3/抗Pgp diabody中抗CD3或抗Pgp轻重链可变区的适当部位定点突变成半胱氨酸,进行原核表达。表达产物经阳离子层析柱和抗Etag亲和层析柱分离纯化,还原性和非还原性SDS-PAGE电泳鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FCM)检测生物学活性。将改造前后的两种抗体分别置37oC含0.2%人血清白蛋白(Human serum albumin,HAS)的PBS中孵育,取多个时间点比较两者与两种把抗原的结合能力。基因重组质粒经测序证实序列正确。向抗Pgp轻重链引入突变的diabody(dsPgp-diabody)在原核表达系统中,SDS-PAGE显示纯化后的蛋白二硫键不能配对。而向抗CD3轻重链引入突变的diabody(dsCD3-diabody)能够在原核表达系统中进行可溶性表达,二硫键能够正确配对。并且与改造前的diabody相比,dsCD3-diabody的抗原结合特异性没有改变,抗原结合和竞争活性均无下降。改造前的diabody在37oCPBS(0.2%HAS)中孵育1h后活性即开始下降,24h后活性完全丧失;而dsCD3-diabody孵育72h后活性并无明显下降。本实验成功构建了dsCD3-diabody,并且能够进行可溶性表达。向diabody抗CD3轻重链区引入的二硫键在宿主菌中可以正确配对,抗原结合活性没有明显下降,而稳定性大大增强。向diabody轻重链区引入二硫键,以增强其稳定性的方法是可行的。; 苏晔刘娟妮高瀛岱秦立杨铭王金宏许元富邵晓枫纪庆熊冬生杨纯正; 关键词：基因工程抗体 DIABODY 二硫键药物稳定性

去除Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体原核表达载体的构建及表达被引量：1: 2007年; 目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定。通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:无Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体经测序证实其序列正确。SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25000和26000,与预期Mr相符。去除Etag的Dia-body[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%。竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%。结论:成功构建了不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化。不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和Pgp靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低。; 刘娟妮高瀛岱王金宏邵晓枫范冬梅纪庆熊冬生杨纯正; 关键词：PGP CD3 DIABODY 基因工程抗体

阿糖胞苷上调耐药白血病细胞共刺激分子表达及其分子机制研究被引量：3: 2007年; 目的研究阿糖胞苷(Ara-C)对耐药白血病细胞共刺激分子表达的影响,并探讨其分子机制。方法以流式细胞术检测K562和K562/A02细胞经Ara-C处理后CD80、CD86分子的表达,进而用RT-PCR方法检测CD80、CD86 mRNA表达以及NF-κB、IAP家族基因表达。结果经Ara-C处理后,K562和K562/A02细胞的CD80、CD86分子表达较对照组明显升高,并且能够下调NF-κB、Survivin、XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)基因表达,而cIAP1、cIAP2(cellular inhibitor of apoptosis-1,2)基因表达变化不明显。结论Ara-C可上调耐药白血病细胞共刺激分子CD80、CD86,相关基因NF-κB、IAP家族为参与其上调CD80和CD86分子的重要基因。; 范冬梅高瀛岱杨铭邵晓枫王金宏纪庆许元富熊冬生杨纯正; 关键词：阿糖胞苷 CD80 CD86

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体对B淋巴细胞凋亡及胞内Ca^(2+)的影响被引量：1: 2006年; 目的研究抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体诱导B淋巴细胞凋亡的发生、凋亡相关基因表达以及细胞内钙离子的浓度变化。方法以人B淋巴细胞(Raji细胞)为凋亡细胞模型,通过MTT法、Western blot和流式细胞仪等方法观察bcl-2/bax基因表达、细胞色素c及胞内Ca2+的变化。结果抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体对Raji细胞生长增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性。细胞中bcl-2表达有微弱的下降,而bax表达明显升高,并出现细胞色素c的释放和胞内Ca2+浓度的升高。结论抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体诱导Raji细胞凋亡,与bcl-2/bax表达、细胞色素c的释放和胞内Ca2+浓度的升高有关。; 杨铭范冬梅熊冬生刘银星许元富杨纯正; 关键词：钙信号 RAJI细胞

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