广东省自然科学基金(033189)
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
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- 用siRNA抑制人基质金属蛋白酶1(MMP1)的表达
- 目的;动脉粥样硬化(AS)所致的心、脑血管疾病在人类死亡原由中占有重要的地位。大量研究已证实,基质金属蛋白酶(MMPs)可降解细胞外基质,软化纤维帽,使斑块趋向不稳定。为了获得能有效抑制MMP1表达的siRNA,分别设计...
- 单志新林秋雄余细勇郑猛谭虹虹符永恒杨敏刘晓颖林曙光
- 人Ⅱ型穿膜蛋白CD74基因片段的克隆及原核表达被引量：3
- 2005年
- 【目的】扩增、克隆人Ⅱ型穿膜蛋白 CD74基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组 CD74蛋白。【方法】根据人 CD74基因序列,设计、合成 PCR 引物,利用 RT-PCR 技术,从人 Raji B 细胞中扩增 CD74基因片段。将CD74基因定向插入原核表达载体 pGEX-4T-1,构建重组表达载体 pGEX-4T-CD74,并转化工程菌 BL21(DE3)。用 IPTG 诱导BL21(DE3)中导入的 CD74基因的表达,并行 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定表达产物。用 GSTrap 亲合柱纯化重组 CD74蛋白,通过体外血管生成实验鉴定重组 CD74蛋白对巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的阻断作用。【结果】扩增出人 CD74基因片段,并成功构建了重组质粒 pGEX-4T-CD74。测序结果显示,克隆的 CD74 cDNA 长480bp,序列与文献报道一致。经 IPTG诱导,特异表达出可溶性的44 KDa 的重组蛋白,其可被人 CD74抗体识别。体外血管生成实验结果显示,重组 CD74蛋白能特异地阻断 MIF 的促血管生成作用。【结论】克隆了人 CD74基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组 CD74蛋白。
- 单志新林秋雄符永恒余细勇
- 关键词：CD74基因表达
- 巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达被引量：2
- 2005年
- 目的:扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法:根据人MIF基因序列,设计、合成PCR引物,利用RT -PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX - 4T - 1,并将构建正确的重组表达载体pGEX - 4T -MIF转化工程菌BL2 1(DE3) ,用异丙基硫代- β-D -半乳糖(IPTG)诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF ,行柱上凝血酶消化,洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验(MMI)鉴定MIF蛋白的生物活性。结果:限制性内切酶分析和DNA测序结果表明,成功构建了重组质粒pGEX - 4T -MIF ,人MIFcDNA长348bp ,编码115个氨基酸。经IPTG诱导,高效表达出可溶的GST -MIF蛋白。SDS -PAGE和Westernblotting分析显示,GST -MIF经凝血酶消化,获得13kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30 % ,具有生物活性。结论:克隆、测定了人MIF基因,在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。
- 单志新余细勇林秋雄杨敏符永恒谭虹虹郑猛林曙光
- 关键词：巨噬细胞游走抑制因子基因表达
- 利用RNAi技术抑制人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达
- 目的:研究发现,MIF作为一种促炎分子参与了动脉粥样硬化的发生、形成过程。RNA干扰(RNAi)技术是下调目的基因表达的有效手段。为了获得能有效抑制MIF表达的siRNA,分别设计、合成4条候选siRNA,研究其对血管内...
- 单志新林秋雄余细勇杨敏郑猛符永恒谭虹虹林曙光
- 文献传递
- 表达载体介导的反义RNA抑制人巨噬细胞移动抑制因子的表达被引量：2
- 2006年
- 目的:研究表达载体介导的反义RNA对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义RNA的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-MIF)细胞,用Real-time定量PCR鉴定MIFmRNA表达水平。将pcDNA3-antiMIF转化人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),建立可表达MIF反义RNA的HUVECs(HUVECs-antiMIF)细胞。将MIF的真核表达载体pSecTag-MIF转染HUVECs-antiMIF,用Real-time定量PCR鉴定MIFmRNA的表达水平。结果:正确构建了MIF反义RNA的表达载体pcDNA3-antiMIF。MIF反义RNA对293-MIF细胞中MIF表达的抑制水平达32%(P<0.05)。建立稳定表达MIF反义RNA的HUVECs-antiMIF细胞株。HUVECs-antiMIF中MIF的表达受到抑制,表达水平降低40%(P<0.05)。结论:表达载体介导的反义RNA能有效地抑制MIF的表达,建立了稳定表达MIF反义RNA的HUVECs。
- 单志新林秋雄余细勇邓春玉杨敏符永恒谭虹虹郑猛林曙光
- 关键词：巨噬细胞游走抑制因子人脐静脉血管内皮细胞脂质体
- 人嗜铬粒蛋白AN-端片段Vasostatin-1(CGA1-76)的原核表达被引量：3
- 2006年
- 目的制备编码人Vasostatin-1基因片段,利用大肠杆菌表达重组Vasostatin-1蛋白。方法根据人Vasostatin-1基因序列,设计、合成3对PCR引物,利用PCR合成法制备编码Vasostatin-1的DNA。将Vasostatin-1基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,行酶切和DNA测序鉴定,并将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的Vasostatin-1基因的表达,行SDS-PAGE分析。用GSTrap亲合柱纯化重组Vasostatin-1蛋白。结果用PCR合成法制备了228bp的Vasostatin-1基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-Vasostatin-1,DNA测序显示Vasostatin-1DNA序列和插入位点正确。经IPTG诱导,特异表达出以包涵体形式存在36kDa的重组Vasostatin-1蛋白。结论制备、克隆了人Vasostatin-1基因片段,并在大肠杆菌中表达出重组Vasostatin-1蛋白。
- 符永恒单志新余细勇林秋雄邓春玉郑猛
- 关键词：分子克隆原核表达
- 用小双链RNA抑制转化入HUVEC中绿色荧光蛋白基因的表达被引量：1
- 2006年
- 目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),研究小干扰RNA(siR-NA)对HUVECs中GFP表达的抑制作用。方法:用lipofectamine2000将编码GFP的质粒pN3-EGFP转入HUVECs中。用G418筛选并维持已转化pN3-EGFP的HUVEC(HUVEC-GFP)。利用T7RNA转录试剂盒,制备可抑制GFP基因表达的siRNA(GFPsiRNA)和无关对照的RNA(control siRNA)。用oligofectamine将siRNA转入HUVEC-GFP中。继续培养48h后,检测HUVEC-GFP中GFP蛋白和mRNA表达水平。结果:用G418筛选获得了HUVEC-GFP细胞株,可以观察到GFP的稳定表达。HUVEC-GFP转化siRNA后48h,GFP的荧光强度明显下降,而对照组的荧光强度无明显下降。半定量RT-PCR检测显示,GFPsiRNA对GFP mRNA表达有较强的抑制作用,抑制率达40%,而control siRNA对GFP mRNA表达水平无明显的抑制作用。结论:利用体外转录合成的siRNA能有效地抑制HUVECs中GFP的表达。
- 单志新林秋雄余细勇邓春玉郑猛谭虹虹符永恒杨敏林曙光
- 关键词：RNA干扰绿色荧光蛋白人脐静脉血管内皮细胞脂质体
