国家自然科学基金(30760251)
- 作品数：15 被引量：22H指数：3
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- 相关机构：昆明医学院第二附属医院中国科学院昆明医学院第一附属医院更多>>
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- 凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价被引量：1
- 2011年
- 凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1∶243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。
- 王春晖王剑松王文举詹辉李鸿钧颜汝平徐鸿毅
- 关键词：VP3蛋白多克隆抗体膀胱肿瘤腺相关病毒
- 改良型TAT—VP3融合基因原核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2010年
- 目的 构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白.方法 采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体pThioHisA中,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.结果 成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明构建正确.经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量16400的特异性目的 条带,37℃诱导8h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白,为进一步的蛋白制备和应用研究奠定了基础.
- 张启波赵庆华詹辉颜汝平杨峻峰李俊王剑松
- 凋亡素体外抗膀胱癌效应观察及应用前景分析被引量：2
- 2009年
- 目的：观察凋亡素诱导不同膀胱癌细胞株凋亡的效果并结合文献评价其临床应用前景。方法：采用凋亡素原核表达载体pBV220／Apoptin、真核表达载体PCDNA3、人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87及EJ、RT—PCR试剂盒以及质粒提取试剂盒。将原核表达载体中的Apoptin基因克隆入真核表达载体PCDNA3，经双酶切及基因测序鉴定无误后。利用脂质体转染法将真核表达质粒PCDNA3／Apoptin转染膀胱癌细胞株BIU-87及EJ。然后于转染后24h利用RT—PCR观察基因表达情况，并分别于转染后24、48、72h利用透射电镜检测肿瘤细胞超微结构变化、MTT法检测细胞存活率、流式细胞仪TUNAL法检测各组细胞的凋亡率，并对结果行统计学分析。结果：成功构建真核表达载体PCDNA3／Apoptin并转染膀胱癌细胞株BIU-87及EJ。转染24h后，通过RT—PCR法可见凋亡素基因在细胞内表达，并于转染后不同时段观察到实验组细胞发生高效凋亡，并随时间的延长而逐步升高，转染后72h，两种细胞株的凋亡率约为65％，而MTT法所测细胞存活率约为25％，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。同时通过透射电镜可观察到实验组多数细胞出现凋亡的超微结构变化，如核边集、核碎裂及凋亡小体等。结论：凋亡素可诱导不同的膀胱癌细胞株发生高效的凋亡。考虑到其具有与小分子化疗药物不同的作用机制，我们认为凋亡素有可能成为克服膀胱癌细胞多药耐药性的新途径之一。
- 詹辉王剑松王春晖袁顺辉左毅刚柯昌兴丁明霞颜汝平王伟刘靖宇徐鸿毅
- 关键词：凋亡素膀胱肿瘤移行细胞癌凋亡
- 膀胱肿瘤BIU-87细胞耐药诱导及逆转的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的诱导BIU-87细胞对羟基喜树碱(HCPT)产生耐药,检测多药耐药相关蛋白和交叉耐药,观察维拉帕米(VPM)逆转耐药性的效果.方法用间隙给药法诱导BIU-87细胞对HCPT产生耐药,MTT法测定交叉耐药性,细胞免疫组化染色检测P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP1)、Bcl-2和生存素Survivin,MTT法和流式细胞仪测定VPM逆转耐药性的效果.结果耐药诱导5个月,BIU-87/HCPT细胞对HCPT、长春新碱(VCR)、丝列霉素(MMC)和顺铂(CDDP)的耐药性均有提高,其中HCPT为55倍,VCR为26.88倍,而对阿霉素(ADM)耐药性提高不明显.经检测P-gp和MRP1均为++,Bcl-2和Survivin均为+++.VPM逆转耐药性有一定效果.结论BIU-87/HCPT细胞具有多药耐药性,对VCR的耐药指数最大,VPM能逆转其耐药性,但逆转效率低于文献报道,这些结果都可能与肿瘤细胞产生多药耐药的机制复杂和BIU-87/HCPT细胞的Bcl-2与Survivin的表达量比P-gp与MRP1高有关.
- 王辉涛王剑松黄训丰詹辉王春晖袁顺辉
- 关键词：羟基喜树碱多药耐药膀胱肿瘤生存素
- 改良型TAT-VP3融合蛋白对膀胱癌BIU-87细胞Bcl-2和Survivin表达的影响被引量：1
- 2012年
- 目的探讨应用改良型TAT-VP3融合蛋白干预膀胱癌BIU-87细胞后,对肿瘤细胞的抑制效应,及对Bcl-2和Survivin表达的影响,为以后对改良型TAT-VP3融合蛋白的进一步研究提供实验基础.方法运用MTT比色法检测BIU-87细胞的生长抑制率.利用不同浓度的改良型TAT-VP3融合蛋白干预膀胱癌BIU-87细胞,24 h,48 h,72 h,运用实时荧光定量酶链聚合反应(QPCR)检测Bcl-2和Survivin mRNA的表达变化.运用不同浓度的改良型TAT-VP3融合蛋白干预膀胱癌BIU-87细胞,24 h后蛋白免疫印迹法(Western Blo)t检测Bcl-2和Survivin蛋白的表达情况.结果改良型TAT-VP3融合蛋白干预膀胱癌BIU-87细胞后,肿瘤细胞凋亡率与时间和剂量呈依赖关系(P<0.05),Bcl-2和Survivin mRNA表达与时间和药物剂量呈依赖关系.不同浓度的改良型TAT-VP3融合蛋白作用24 h后,Bcl-2和Survivin蛋白表达与药物剂量呈依赖关系.结论改良型TAT-VP3融合蛋白对膀胱癌BIU-87细胞具有一定的抑制作用,并对凋亡相关因子(Bcl-2和Survivin)的表达有影响.
- 马真李俊王剑松詹辉王春晖张之甲
- 关键词：VP3蛋白膀胱癌BCL-2SURVIVIN
- 凋亡素体外诱导表达Survivin膀胱癌细胞凋亡效果观察
- 2009年
- 目的:观察凋亡素对表达Survivin膀胱癌细胞株的作用效果,并结合相应机制探讨其临床意义。方法:利用免疫组织化学法检测膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin的表达水平,并计算平均每高倍镜视野中阳性细胞比率。将肿瘤细胞分为单纯细胞组、转染空质粒pCDNA3组及转染pCDNA3/Apoptin组,利用脂质体转染法将真核表达载体pCDNA3/Apoptin及pCDNA3空质粒转染入膀胱癌细胞中,并于转染后24h通过RT-PCR法检测细胞中Apoptin的表达情况。分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,并利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率。结果:利用免疫组织化学法检测发现膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin呈高表达状态,平均每个高倍镜视野中阳性细胞比例约70%,并有较多细胞呈现高表达状态。转染后24h通过RT-PCR法可见Apoptin在膀胱癌细胞中表达。分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞存活率均明显低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05);利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞凋亡率均明显高于对照组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:凋亡素可在体外诱导高表达Survivin的膀胱癌细胞株BIU-87高效凋亡,结合相关机制表明凋亡素可在一定程度上克服Survivin的抗凋亡作用,因此有可能成为Survivin拮抗的抗肿瘤药物的协同用药选择。
- 詹辉王剑松严勇王春晖袁顺辉左毅刚柯昌兴丁明霞颜汝平
- 关键词：凋亡素SURVIVIN凋亡膀胱肿瘤移行细胞癌
- RNA干扰靶向Survivin促进膀胱癌细胞株BIU-87细胞凋亡的研究被引量：2
- 2010年
- 目的针对凋亡抑制因子Survivin应用RNA干扰技术(RNA interference,RNA)i抑制膀胱癌细胞株BIU-87细胞内源性Survivin基因的表达进而促进膀胱癌细胞株BIU-87细胞凋亡.方法构建重组质粒pshRNA-survivin1、pshRNA-surv-ivin2和pshRNA-survivin 3并转染BIU-87细胞株,应用免疫组化法检测细胞中Survivin蛋白的表达,通过噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞生长增殖抑制率,利用流式细胞术检测细胞凋亡率.结果重组质粒转染BIU-87细胞后,Survivin蛋白表达明显下调,细胞凋亡率显著增加,细胞生长明显受抑.结论膀胱癌细胞高表达Survivin,RNA干扰特异性抑制Survivin表达,可以促进膀胱癌细胞凋亡和增殖活性明显下降.
- 严勇李克功詹辉丁明霞王春晖王剑松
- 关键词：RNA干扰SURVIVIN膀胱肿瘤
- 组织芯片技术检测肿瘤相关抗原在膀胱癌、癌旁组织中的表达被引量：3
- 2009年
- 目的利用组织芯片技术检测人膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)组织、癌旁组织中肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)的表达.方法含40块不同病理分级的人膀胱癌和40块癌旁组织组合的组织芯片一张,含64块不同病理分级的人BTCC组织芯片一张.免疫组织化学Elivision法检测膀胱癌组织和癌旁组织中TAA的表达,并对不同病理分级BTCC组织中TAA的阳性表达率进行比较.结果膀胱癌TAA的阳性染色主要位于细胞膜,BTCC组织中的总表达率为72.5%(29/40),癌旁组织中的总表达率为30%(12/40),差异有统计学意义(P<0.05).96块不同病理分级的BTCC组织中,TAA的阳性表达率分别是:G1 64.3%(9/14)、G2 69.8%(30/43),G3 74.4%(29/39).两两比较,TAA在G1、G2和G3中的阳性表达无差异性,P>0.05,差异无统计学意义.结论膀胱癌组织中TAA的阳性表达率显著高于癌旁组织,TAA的表达和BTCC病理分级无关.组织芯片技术是检测膀胱癌TAA的一种有效方法,具有高效、快捷的优点.
- 颜汝平王剑松李翀柯昌兴左毅刚刘靖宇
- 关键词：膀胱癌组织芯片免疫组织化学
- 改良型TAT-VP3融合蛋白对膀胱癌的抑制效应研究
- 2012年
- 目的探讨改良型TAT-VP3融合蛋白对膀胱癌细胞的抑制效应,为其临床应用于肿瘤的生物大分子药物治疗提供实验基础。方法运用免疫细胞化学染色法确定改良型TAT-VP3融合蛋白进入到膀胱癌细胞EJ的细胞核内,CCK-8检测EJ细胞的生长抑制率,通过透射电镜观察凋亡细胞的超微结构变化,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果改良型TAT-VP3融合蛋白进入膀胱癌EJ细胞核内;经该融合蛋白作用后,EJ细胞凋亡率呈时间和剂量依赖关系,细胞周期随着药物作用浓度和时间的增加而改变,EJ细胞的生长抑制率随其浓度的增加和作用时间的延长而呈明显上升趋势。结论改良型TAT-VP3融合蛋白对膀胱癌EJ细胞的增殖具有一定的抑制作用,并对该细胞具有凋亡诱导作用。
- 李俊张之甲韩冰冰詹辉王剑松张启波马真
- 关键词：细胞凋亡VP3蛋白膀胱癌
- 凋亡素联合不同化疗药物体外抗膀胱癌效应观察被引量：4
- 2010年
- 目的观察凋亡素联合化疗药物吉西他滨及多西紫杉醇的体外抗膀胱癌效果,评价该蛋白的临床应用前景。方法将原核表达载体pBV220/Apoptin中的Apoptin基因克隆入真核表达载体PCDNA3后,转染人膀胱尿路上皮癌细胞株EJ,利用RT-PCR观察基因表达情况,MTT法和流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率,并行统计分析。结果成功构建真核表达载体PCDNA3/Apoptin并转染膀胱癌细胞株EJ,并于转染后不同时段观察到联合用药组肿瘤细胞的抑制率与凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。结论凋亡素与吉西他滨或多西紫杉醇联合应用可发挥协同抗膀胱癌效应,凋亡素具有良好的临床应用前景。
- 王剑松詹辉罗群强袁顺辉李天庆王伟刘靖宇
- 关键词：膀胱肿瘤凋亡素吉西他滨多西紫杉醇
