国家自然科学基金(30971144)
- 作品数：3 被引量：9H指数：1
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- 人肌球蛋白调节性轻链的原核表达及纯化被引量：1
- 2013年
- 目的:构建pGEX-MLC2重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化谷胱甘肽硫转移酶(GST)-MLC2融合蛋白,以用于MLC2抗体的制备。方法:从人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得人MLC2cDNA全长开放读码框架(open reading frame,ORF),并将其重组于原核蛋白表达质粒pGEX-6P-1中,经限制性内切酶和DNA测序鉴定,将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC2融合蛋白后,进行Western blotting分析,鉴定GST-MLC2蛋白;通过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白的纯度。结果:人乳腺癌MCF-7细胞MLC2的RT-PCR产物为535 bp,符合预期;重组质粒pGEX-MLC2经BamHI和EcoRI双酶切出现特征性的525 bp片段;DNA测序证实MLC2全长ORF序列正确无误。IPTG诱导表达的GST-MLC2融合蛋白分子质量约为46.6 kDa,纯化后其蛋白纯度约95%,经Western blotting分析表明诱导表达的蛋白是GST-MLC2融合蛋白。结论:人MLC2蛋白原核表达质粒的构建、GST-MLC2融合蛋白的表达和纯化,为MLC2抗体的制备及MLC2功能的深入研究奠定了基础。
- 陈洋何泽张永臣万青赵虎子赵蕾沈传陆
- 关键词：原核表达GST融合蛋白蛋白纯化
- 肌球蛋白轻链的调节及其对肿瘤细胞增殖、转移的影响被引量：9
- 2010年
- 肌球蛋白作为一种超家族蛋白质,是细胞骨架的重要组成部分,通过各种调节因子对其轻链磷酸化和去磷酸化的调节,参与了几乎所有的细胞生理、病理过程,尤其在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用。到目前为止,肿瘤的发生、发展机制还不是十分清晰,对肌球蛋白轻链的调节及其与肿瘤相关性的研究,将有助于阐明肿瘤的发生、发展机制,为肿瘤的靶向治疗提供依据。
- 王丛阳王辉沈传陆
- 关键词：肌球蛋白轻链磷酸化去磷酸化肿瘤
- 癌蛋白PRC17与人肌球蛋白调节轻链相互作用的初步鉴定
- 2014年
- 目的:分析前列腺癌基因17(PRC17)与人肌球蛋白调节轻链(MLC2)之间的相互作用,并鉴定PRC17蛋白序列上与MLC2相互作用的功能区域。方法:经大肠杆菌表达并用Glutathione Sepharose 4B纯化GST及融合蛋白GST-MLC2,用SMMC-7721细胞表达带HA标签的PRC17及其截短突变体HA-PRC17(353)、HA-PRC17(251)、HA-PRC17(164)和HA-PRC17(Δ164),GST沉淀实验分析GST-MLC2与PRC17及其截短体的相互作用。结果:经诱导表达并纯化的GST和GST-MLC2分子质量符合预期,分别约为28.4 kD和46.6 kD,纯度均95%以上;GST沉淀实验结果显示,PRC17结合MLC2,不结合阴性对照GST;PRC17(353)和PRC17(251)也能有效结合MLC2,但PRC17(164)和PRC17(Δ164)都不能与MLC2结合。结论:PRC17能特异性结合MLC2,其蛋白序列上与MLC2结合的部位位于其氨基端251位氨基酸之内,可能在164位氨基酸附近。
- 何泽陈洋张永臣万青赵虎子赵蕾沈传陆
- 关键词：肌球蛋白轻链融合蛋白相互作用
