广东省自然科学基金(06020897)
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
- 相关作者：戴波肖定璋余细勇谢至郭爱林更多>>
- 相关机构：广东省人民医院南方医科大学更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- RNA干扰沉默MIF基因对HeLa细胞生长、迁移和黏附性的影响被引量：2
- 2009年
- 目的:探讨巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)对宫颈癌HeLa细胞生长、迁移和黏附能力的影响。方法:通过反转录病毒载体介导RNA干扰,获得稳定抑制MIF表达的HeLa细胞株。Western印迹法检测MIF蛋白沉默效果以及FAK、ICAM-1、Bax和Bcl-2蛋白表达情况。观察HeLa细胞生长状态的变化,采用迁移实验、黏附实验和软琼脂糖克隆形成实验检测MIF对HeLa细胞迁移和黏附能力的影响。通过裸鼠成瘤实验观察沉默MIF基因后HeLa细胞的成瘤效果。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)和放线菌酮(cycloheximide,CHX)诱导细胞凋亡后,FCM法检测沉默MIF基因对HeLa细胞凋亡的影响。结果:构建获得稳定抑制MIF蛋白表达的HeLa-pSUPER-MIF细胞株。MIF基因沉默后细胞生长减慢,迁移能力和黏附功能减弱;HeLa细胞中FAK、ICAM-1的表达量减少,无法在裸鼠中形成肿瘤;同时能减少TNF-α和CHX诱导的细胞凋亡,并且使Bax表达量下降。结论:MIF通过影响HeLa细胞中FAK、ICAM-1的表达,促进肿瘤细胞生长,增加肿瘤细胞的迁移和黏附能力,因此MIF可能是肿瘤形成过程中的重要因子。
- 戴波肖定璋余细勇郭爱林谢至
- 关键词：RNA干扰巨噬细胞游走抑制因子细胞生理学HELA细胞
- 人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达被引量：5
- 2008年
- 目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14)基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA,RT-PCR扩增出Fn14基因全长cDNA,经测序正确后,核酸内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ酶切PCR产物,亚克隆入pcDNA 3.1-Myc载体,重组质粒pcDNA 3.1-Myc-Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞,通过免疫组织化学DAB法检测Myc-Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA 3.1-Myc-Fn14经EcoRⅠ、XbaⅠ酶切及测序鉴定正确,重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示,重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc-Fn14融合蛋白,转染空载体pcD-NA 3.1-Myc的COS-7细胞未见Myc-Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体,该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白,为研究Fn14功能奠定了基础。
- 肖定璋杨挺戴波余细勇
- 关键词：基因克隆真核表达重组质粒
- siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选被引量：1
- 2008年
- 目的:构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子(MIF)特异性siRNA重组逆转录病毒载体,将其导入PHOENIX细胞中,筛选出分泌MIF-siRNA病毒的包装细胞,其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达,并初步了解稳定沉默MIF细胞株的特性。方法:体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体,构建的载体通过酶切、测序鉴定后,采用脂质体介导转染包装病毒细胞株PHOENIX,收获病毒上清;将其感染HeLa细胞株,经过嘌呤霉素筛选得到抑制MIF表达的HeLa细胞株。Western blotting鉴定MIF表达的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa-pSuper-MIF和HeLa-pSuper-mock之间的特性。结果:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF,转染包装病毒细胞株PHOENIX,病毒上清感染HeLa细胞,抑制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达。沉默MIF蛋白后导致HeLa细胞迁移能力下降,不依赖支持物生长的特性减弱和黏附能力下降,同时稳定表达沉默MIF蛋白的细胞株生长周期停留在G0/G1期与对照组相比凋亡减少。结论:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF,转染包装细胞所产生的病毒上清,能够抑制HeLa细胞内的MIF蛋白表达,表明MIF对HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。
- 戴波肖定璋余细勇
- 关键词：巨噬细胞移动抑制因子RNA干扰逆转录病毒载体
