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RAN1基因过表达抑制嗜热四膜虫大核无丝分裂被引量：6: 2013年; Ran GTPase通过RanGTP/RanGDP循环的形式,参与调控多种细胞增殖方式:包括有丝分裂和减数分裂.敲减RAN1基因可导致嗜热四膜虫大核内微管组装紊乱,从而抑制大核无丝分裂.为进一步分析Ran1在无丝分裂中的功能,本研究将野生型Ran1以及模拟GTP(Ran1Q70L)和GDP(Ran1T25N)锁定形式的Ran1突变体在嗜热四膜虫中过量表达,均导致四膜虫细胞增殖速率下降,并引起大核无丝分裂异常,且这种核异常细胞比率与Ran1过表达量呈正相关.免疫荧光定位结果显示,过表达的HA-Ran1在整个细胞中弥散分布,破坏了正常的Ran1分布形式;而过表达的HA-Ran1Q70L明显集中在大核核膜和胞质中,HA-Ran1T25N则主要定位在大核和小核内,分别与Ran1GTP/Ran1GDP循环的辅助调节因子定位模式一致.以上结果表明,过表达Ran1及其突变体可能影响嗜热四膜虫细胞中正常的Ran1GTP/Ran1GDP循环,进而导致大核无丝分裂异常.; 梁海霞许静王伟; 关键词：RAN GTPASE 无丝分裂嗜热四膜虫

嗜热四膜虫δ微管蛋白基因的克隆、鉴定及细胞定位被引量：5: 2013年; 微管蛋白(tubulin)在细胞的结构和功能中发挥着重要作用,α微管蛋白和β微管蛋白是组成微管的主要因子,γ微管蛋白促使α和β微管蛋白二聚体组装为微管结构.然而,4种新的微管蛋白δ-,ε-,ζ-,和η-tubulin在细胞中的功能并不完全清楚.本研究从嗜热四膜虫大核基因组数据库中鉴定了一种新的编码δ微管蛋白基因(Tetrahymena delta tubulin 1,TDT1,TTHERM_00335970,http://www.ciliate.org),TDT1基因转录产生1 326 bp和1 363 bp两种不同的转录本,1 326 bp的转录本编码441个氨基酸的多肽;而1 363 bp的转录本含有37 bp未剪切的内含子序列,从而导致开发读框发生移码突变现象.实时荧光定量PCR结果表明,TDT1基因在四膜虫细胞营养生长和有性生殖过程中都有表达,且在有性生殖过程中的表达显著上调.免疫荧光定位表明,TDT1蛋白不仅定位于四膜虫基体和有性生殖期conjugation junction结构,而且在四膜虫的大核和小核中也有定位.TDT1基因敲除发现,该基因不能通过表型分配完全被巴龙霉素抗性基因替代,结果表明,TDT1蛋白在四膜虫细胞中可能具有多种不同的功能,它的正常表达对四膜虫细胞的生存是必需的.; 许静王伟梁爱华; 关键词：基因表达谱细胞定位嗜热四膜虫

抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性被引量：5: 2015年; 组蛋白H3/H4的分子伴侣Asf1（anti-silencing factor 1）,参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配,同时参与转录调控、基因沉默以及DNA损伤修复等过程.在不同生物中,Asf1具有功能的保守性和多样性.嗜热四膜虫ASF1（TTHERM_00442300）基因编码的蛋白质含有保守的N端结构域和酸性的C端结构域.N端结构域同源序列进化树分析表明,Asf1进化与物种进化一致.实时荧光定量PCR表明,ASF1在四膜虫营养生长、饥饿及有性生殖时期均有表达,且在有性生殖4～6 h转录水平达到最高.免疫荧光定位分析表明,HA-Asf1在营养生长时期以及有性生长时期定位于功能大核和小核中,而在凋亡的大核中信号消失.过表达ASF1导致大核及小核变大,抑制细胞增殖.敲减ASF1后会导致大核形态异常,小核缺失.结果表明,ASF1表达对细胞核的形态和结构维持发挥重要的调控作用.; 陈波许静王伟; 关键词：嗜热四膜虫细胞定位

绿色荧光蛋白表达载体pXS75-GFP的构建及在嗜热四膜虫中的应用: 2012年; 为获得能够用于构建嗜热四膜虫蛋白定位的载体,该研究将GFP基因与镉(Cd2+)诱导的四膜虫金属硫蛋白基因(MTT1)启动子序列和终止子序列融合,获得表达载体pXS75-GFP。通过同源重组和抗性筛选,pXS75-GFP载体携带的目的基因整合入四膜虫MTT1位点,在Cd2+诱导下实现GFP融合蛋白的可控表达。将α-tubulin基因ATU1克隆入pXS75-GFP中,重组质粒pXS75-GFP-ATU1通过基因枪转化入四膜虫细胞,在巴龙霉素筛选下获得稳定的α-tubulin-GFP过表达细胞株。激光共聚焦显微镜观察α-tubulin-GFP的定位,结果显示,α-tubulin-GFP融合蛋白在四膜虫细胞中表达并分布于皮层上,表明pXS75-GFP载体可用于嗜热四膜虫功能蛋白的定位分析。; 梁海霞王伟; 关键词：绿色荧光蛋白蛋白定位嗜热四膜虫

RanGTPase激活蛋白RanGAP在嗜热四膜虫细胞中的定位及功能被引量：2: 2015年; RanGTPase激活蛋白（RanGTPase-activating protein，RanGAP）和Ran相互作用，提高了RanGTPase水解GTP的效率．RanGAP参与细胞内核质运输、纺锤体组装、核膜重建和异染色质的组装．生物进化过程中，不同生物的RanGAP表现出结构和功能的多样性．本研究从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出1个保守的RanGTPase激活蛋白基因RanGAP（TTHERM_00766430）．实时荧光定量PCR表明，RanGAP在四膜虫营养生长、饥饿和有性生殖过程中均有表达，且在有性生殖4～6h表达水平最高．免疫荧光定位表明，在营养生长期、饥饿期及有性生殖的早期，RanGAP定位于细胞质中；在有性生殖后期，RanGAP定位于凋亡的大核中．过表达RanGAP的细胞增殖速率下降，大核分裂和胞质缢缩异常，产生无大核细胞．敲减RanGAP的细胞大核形态异常，细胞增殖速率下降，无丝分裂受到抑制，进而产生无大核细胞．RanGAP的过表达或敲除分别引起四膜虫RAN1，RanBP1和RCC1基因的表达下调或上调．结果表明，RanGAP通过Ran信号通路调控了嗜热四膜虫无性生殖过程中大核的无丝分裂，并可能参与了有性生殖过程中亲本大核的凋亡．; 任晓琦许静王伟; 关键词：嗜热四膜虫无丝分裂凋亡

嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子(RCC1)的定位及功能被引量：1: 2014年; 真核细胞中染色体浓缩调节因子(regulator of chromosome condensation 1,RCC1)是RanGTPase唯一的鸟嘌呤核苷酸交换因子.染色质结合的RCC1和RanGTPase相互作用,催化细胞核内RanGDP向RanGTP的转化,进而调控了核质间的定向运送、有丝分裂期纺锤体的组装以及核膜的形成.本实验从原生生物嗜热四膜虫大核基因组中鉴定了1个新的RCC1(TTHERM_00530380)基因.该基因全长2 541 bp,包含2个内含子序列,开放阅读框为2 181 bp,编码726个氨基酸.实时荧光定量PCR表明,RCC1在四膜虫营养生长、饥饿以及有性生殖时期都有表达,且在有性生殖转录水平达到最高.免疫荧光定位分析表明,HA-RCC1在营养生长和饥饿时期,定位于大核和小核中;在有性生殖时期,定位于亲本大核、减数分裂的小核、新生成的大核和凋亡的大核中.过表达RCC1导致大核的无丝分裂异常,细胞增殖变慢,最终产生无大核的后代细胞.敲减RCC1导致了多小核的产生.结果表明,RCC1参与调控了四膜虫细胞核的分裂,RCC1的正常表达对核分裂以及细胞增殖起到重要的调控作用.; 段文靖许静王伟; 关键词：嗜热四膜虫细胞定位核分裂

含荧光素酶四膜虫B2086-LUC全细胞生物传感器的构建及其对重金属离子的响应被引量：4: 2013年; 为了获得可用于快速检测环境中重金属污染的全细胞生物传感器,本研究将含有HA标签的萤火虫荧光素酶(LUC)基因重组到含有四膜虫金属硫蛋白MTT1启动子和微管蛋白终止子序列的载体pBX中,获得重组质粒pBX-LUC,用基因枪粒子轰击法将pBX-LUC转化入四膜虫细胞中,通过同源重组和巴龙霉素抗性筛选,LUC基因整合到四膜虫大核基因组MTT1位点,获得含有LUC基因的细胞株B2086-LUC.B2086-LUC对重金属镉和汞的响应敏感,可检测的最低浓度为5-10ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.5-1mg/mL.因此,四膜虫B2086-LUC可作为环境中镉和汞污染快速检测的全细胞生物传感器.; 张鹏幸许静卢剑功王伟; 关键词：萤火虫荧光素酶嗜热四膜虫汞生物传感器

嗜热四膜虫Ran结合蛋白1的表达对大小核分裂的影响被引量：2: 2013年; Ran是细胞内的一种具有GTP酶活性的功能蛋白,可以调节染色体稳定性、细胞核组建以及核质运输等多种细胞进程.Ran结合蛋白1(Ran-binding protein 1,Rbp1p)是Ran的必要调控因子,促进Ran-GTP水解为Ran-GDP.本研究从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出1个保守的Ran结合蛋白基因RBP1(TTHERM_00158040,http://www.ciliate.org).实时荧光定量PCR表明,RBP1在四膜虫营养生长和有性生殖过程中都有表达,且在有性生殖过程中表达水平提高.免疫荧光定位表明,在营养生长期Rbp1p定位于细胞质中.过表达RBP1或敲减RBP1后,细胞生长速率下降,大核的无丝分裂异常,细胞分裂末期产生了无大核的异常细胞,同时过表达RBP1导致了多小核的产生.结果表明,Rbp1p影响四膜虫细胞核的分裂进程,它的正常表达对细胞增殖过程起到重要的调节作用.; 赵丹梁海霞许静王伟; 关键词：嗜热四膜虫核分裂

嗜热四膜虫两类不同金属硫蛋白的功能补偿分析被引量：5: 2014年; 为了分析嗜热四膜虫两类金属硫蛋白之间的关系,研究分别构建了MTT1-MTT3和MTT2-MTT4的基因敲除载体,通过同源重组获得敲除大核MTT1-MTT3和MTT2-MTT4的两种嗜热四膜虫突变体细胞株△MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4。两种突变体细胞株暴露在Cd2+、Cu2+和H2O2的生长表现出显著不同,△MTT1-MTT3突变体细胞对Cd2+的耐受性显著下降,而△MTT2-MTT4突变体细胞对Cu2+和H2O2的耐受性均显著下降。实时荧光定量PCR分析不同突变体中其他MTT基因的表达变化,在△MTT2-MTT4突变体细胞株中,MTT5的表达水平下调,在500μmol/L Cu2+处理后,△MTT2-MTT4突变体细胞中MTT1、MTT3和MTT5表达相对野生型分别上调6.1、9.5和8.5倍。在△MTT1-MTT3突变体细胞中,MTT2、MTT4和MTT5的表达水平下调,当5μmol/L Cd2+处理后,△MTT1-MTT3突变体细胞株MTT5表达水平相对野生型上调2.9倍,而MTT2和MTT4表达水平相对野生型分别下降了4.9倍和2.5倍。结果表明嗜热四膜虫中的金属硫蛋白MTT1、MTT3和MTT5主要参与细胞的重金属解毒功能;而MTT2和MTT4主要参与细胞内正常的新陈代谢功能,不同的金属硫蛋白基因之间的表达存在相互调控和功能补偿。; 卢剑功许静张鹏幸王伟; 关键词：嗜热四膜虫金属硫蛋白基因敲除

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教育部科学技术研究重点项目(201026)

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