天津市自然科学基金(09JCZDJC17500)
- 作品数：6 被引量：15H指数：2
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- PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用
- 2010年
- 目的制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体，鉴定其特异性，并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法构建原核表达质粒pGEX-5X-1．PIWIL4，转化大肠杆菌BL21，PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清。以间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价，Westernblot鉴定抗体特异性及检测PIWIL4在各细胞系中的表达差异，免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位。结果成功构建原核表达质粒，表达并纯化PIWIL4蛋白。免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体，ELISA检测抗体效价为1：20000，Westernblot和免疫组化确定抗体具有高度特异性，并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位。结论PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备，为进一步研究PIWIL4的生物学功能奠定了基础。
- 苏畅浦永孔鹏洲王萌刘民汤华
- 关键词：原核表达抗体肿瘤
- 筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA被引量：2
- 2012年
- 目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。
- 章广玲王梅梅朱丽华熊亚南李怡璇刘民汤华袁丽杰
- 关键词：MIRNA乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒表面抗原
- 慢病毒介导的甲胎蛋白敲减表达抑制肝癌细胞HepG2的增殖被引量：1
- 2010年
- 甲胎蛋白(AFP)是原发性肝癌的标志物.本实验室前期研究表明,AFP的表达与肝癌细胞的增殖及细胞周期相关.为了建立高效稳定的AFPsiRNA细胞导入方法,本研究构建了AFP慢病毒siRNA干涉载体pRNAT-U6.2/AFPsiRNA.并将其转入HEK293细胞后,Western印迹表明,pRNAT-U6.2/AFPsiRNA的干扰效率为88.7%(P<0.05).pRNAT-U6.2/AFPsiRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞包装成慢病毒后感染HepG2细胞,感染3 d时GFP的表达量达95%,感染35 d的子代细胞中GFP的表达量仍稳定在85%.GFP表达量的观察显示,慢病毒载体可以高效并稳定表达外源基因.Western印迹结果也显示,HepG2细胞被病毒感染3 d和25 d后,AFP表达水平均有降低,抑制率分别为74.8%和63.4%(P<0.05).克隆形成实验表明,AFP沉默后,细胞克隆形成个数降低63%(P<0.01),表明HepG2细胞增殖能力受到抑制.
- 张艳强冉唐晓燕李怡璇刘民李欣汤华
- 关键词：HEPG2细胞甲胎蛋白RNA干扰慢病毒
- 纤维连接蛋白1的原核表达、纯化及抗体的制备
- 2010年
- 目的构建人纤维连接蛋白1（FN1）基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性抗体。方法利用RT—PCR方法扩增人FN1编码序列450bp的片段，包含FN1羧基端的150个氨基酸。构建原核表达质粒pRSETA2-FN1，转化大肠杆菌BL21（DE3），FN1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过Ni^2＋-NTA树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组化检测其特异性。结果成功构建重组质粒pRSETA2-FN1，限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序均显示插入片段正确。SDS—PAGE凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为20000（FN1-His标签），与预期结果一致。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价约为1：10000，Western blot显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系HepG2全细胞裂解液中相对分子质量约250000的纤维连接蛋白。免疫组织化学可显示FN1在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。结论成功地原核表达了FN1C-末端蛋白，并免疫获得了抗FN1特异性抗体。
- 王菲菲苏畅吴海东王萌孔鹏洲刘民李欣汤华
- 关键词：纤维连接蛋白基因表达抗体癌症
- 病毒性肝炎患者高迁移率族蛋白1的水平及其临床意义被引量：4
- 2010年
- 目的研究晚期炎症介质高迁移率族蛋白1(HMGB1)在慢性肝炎及重型肝炎中的临床意义。方法选择慢性乙型病毒性肝炎患者56例、重型乙型病毒性肝炎患者28例、健康对照者20例,应用ELISA法检测血清HMGB1水平;同时检测相关生化指标、肝纤维化指标、凝血酶原时间(PT)。结果重型肝炎组HMGB1水平高于慢性肝炎组及正常对照组(P<0.01),且慢性肝炎组高于正常对照组(P<0.01);慢性肝炎组HMGB1水平随病情严重程度增加而增高(P<0.01)。HMGB1水平与谷丙转氨酶、总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶、透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原、PT水平呈正相关,与白蛋白水平呈负相关。结论血清HMGB1含量可作为评价慢性病毒性肝炎病情严重程度的可靠指标。
- 傅煜李顺天汤华
- 关键词：高迁移率族蛋白1
- MiR-141增强人血管内皮细胞增殖及迁移能力被引量：8
- 2010年
- 目的研究microRNA对血管内皮细胞增殖及迁移能力的影响,以阐明microRNA在血管新生过程中发挥作用的分子机制。方法用microRNA的反义寡核苷酸序列封闭microRNA的功能后,用四甲基氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)进行筛查,分析血管内皮细胞增殖活性。随后封闭或过表达这些microRNA,用MTT、集落形成和迁移实验检测细胞的增殖和迁移能力。结果有7种microRNAs对血管内皮细胞的生长有促进作用。其中封闭miR-141的功能后,细胞生长受抑制最明显,且集落形成能力和细胞迁移能力也明显下降。相反,过表达miR-141后,细胞增殖和迁移能力明显增强。结论 miR-141能够增强血管内皮细胞的增殖和迁移能力,起到促进血管新生的作用。
- 刘大全李东华刘洪斌
- 关键词：MICRORNA血管内皮细胞血管新生
