国家重点基础研究发展计划(2011CB710801)
- 作品数：10 被引量：12H指数：2
- 相关作者：吴洽庆朱敦明陈曦冯进辉任杰更多>>
- 相关机构：中国科学院天津工业生物技术研究所天津科技大学江南大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划天津市科技计划中国科学院知识创新工程重要方向项目更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 嗜热共生杆菌内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶中Y76对辅酶偏好性影响被引量：2
- 2015年
- 辅酶NAD(H)相比NADP(H)有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环方法等优势,因此在实际应用中常需将NADP(H)依赖型的脱氢酶改造成为NAD(H)依赖型的。来源于嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum的NADP(H)依赖型内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-2,6-diaminopimelate dehydrogenase,St DAPDH)及其突变体酶是催化还原氨化合成D-氨基酸的优良催化剂,本研究试图改变其辅酶偏好性,增强其应用优势。对其晶体结构分析可知,氨基酸残基Y76距离腺嘌呤较近,R35及R36和辅酶上磷酸基团有直接相互作用。依氨基酸侧链基团性质对Y76进行了定点突变,发现不同突变子对两种辅酶的偏好性都发生了变化;对与磷酸基团直接作用的R35、R36进行的双突变R35S/R36V,导致酶对NADP+的催化活力降低;将R35S/R36V和部分Y76突变进行了组合,发现三突变组合以NAD+为辅酶时的活力均大于以NADP+为辅酶的活力,实现了辅酶偏好性转变。这些研究工作为进一步实现St DAPDH的辅酶偏好性完全转变提供依据。
- 赵雷明刘卫东陈曦王敏冯进辉吴洽庆朱敦明
- 关键词：突变
- 烯酮/烯酯还原酶的菌株筛选及基因克隆和酶性质研究
- 光学活性化合物由于其所具有的独特优势,越来越多的受到人们的关注。由于不对称催化还原C=C键,同时可以产生2个手性中心,因此这是最广泛用于制备手性化合物的策略之一。古老黄色酶家族（OYE）可以催化还原很多有商业用途的底物。...
- 张海灵高秀珍任杰冯进辉张同存吴洽庆朱敦明
- 关键词：基因克隆
- 文献传递
- 生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去对称性水解合成光学纯巴氯芬的关键前体被引量：4
- 2013年
- 研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸。以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberellaintermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件进行了初步研究。以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分别为碳、氮源,发酵培养96 h,收集的菌体在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)中30℃催化反应24 h,将3-(4-氯苯基)-戊二腈转化为4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸,产率为90%。将产物化学转化为巴氯芬,手性HPLC分析表明水解产物构型是(S),其对映异构体过量值ee>99%。该产物可以用来合成光学纯的(R)-和(S)-巴氯芬。
- 徐美珍任杰龚劲松董文玥吴洽庆许正宏朱敦明
- 关键词：腈水解酶巴氯芬
- 不对称还原大位阻二芳香基甲酮的羰基还原酶的基因克隆及性质分析被引量：1
- 2013年
- 由于二芳香基甲酮的位阻大及羰基两侧的取代基差异性较小,对其进行不对称还原是生物催化中具有挑战性的难题之一。文中通过对毕赤酵母GS115基因组序列的分析,发现了一个潜在羰基还原酶基因pascr。将该基因克隆、表达在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中,通过Ni-NTA对重组蛋白进行了分离纯化,并对酶的性质进行了研究。PasCR专一性利用NADPH作为辅酶,其最适反应pH为6.5;最适反应温度为35℃;凝胶层析实验结合SDS-PAGE分析表明PasCR在溶液中以二聚体形式存在。PasCR能够不对称还原位阻较大的二芳香基甲酮类化合物,如4-甲基二苯甲酮、4-氯二苯甲酮、2-氯二苯甲酮等,对4-甲基二苯甲酮的还原产物的ee值达到了85%。
- 李哲刘卫东陈曦贾士儒吴洽庆朱敦明马延和
- 关键词：生物催化羰基还原酶毕赤酵母
- 不对称还原α-氨基苯乙酮菌种的筛选及转化条件优化被引量：3
- 2012年
- 芳香基手性胺醇是许多手性药物合成的重要手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重要方法之一.以α-氨基苯乙酮盐酸盐为模型底物从土壤中筛选获得两株能分别高立体选择性催化底物产生R型、S型相应醇的菌株,对映体过量值(e.e.)分别为99%和77%,编号为1403和4802,鉴定菌株所属为镰刀菌属和地霉属.对两株菌培养时期和转化条件的研究表明镰刀菌1403最适生长时间为24 h,最优菌体浓度20 g/L,最优底物浓度5 g/L;地霉4802最适生长时间24 h,最优菌体浓度80 g/L,最优底物浓度3 g/L.底物特异性研究表明,菌株1403和4802均可转化α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羟基苯乙酮和苯乙酮为相应醇,且以α-羟基苯乙酮为底物时,其产物均为S型,e.e.值达99%.
- 生措任杰王敏吴洽庆朱敦明
- 关键词：镰刀菌属
- 氧化还原酶的改造与手性胺的不对称合成
- 手性胺是许多医药、农药等精细化学品的结构单元,特别是合成神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的重要中间体。但是手性胺的合成还是面临着巨大挑战,因此美国化学会绿色化学圆桌会议将手性胺的合成列为有机合成的...
- 刘卫东高秀珍李广悦冯进辉吴洽庆朱敦明
- 关键词：单胺氧化酶
- 文献传递
- 分枝杆菌核糖体的制备与初步结构研究
- 2016年
- 核糖体是抗生素的主要靶点,而获得足量高纯度的核糖体是进行结构和药物研究的基础。结核分枝杆菌壁厚且生长缓慢,制备足量高纯度的核糖体具有挑战性。本研究改进并优化了核糖体纯化制备方法,通过大量培养和安全处理致病菌,应用高效破碎厚壁革兰阳性菌的技术,结合传统的蔗糖密度离心分离和蛋白液相色谱纯化技术,经多步纯化和分离,获得了高纯度和较高产率的耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌的核糖体样品,为后续生化实验和结构生物学研究提供了保证。该分枝杆菌核糖体制备方法也可应用于其他革兰阳性致病菌复合物样品的直接提纯,以及复合物特异性的进一步研究,特别是利用晶体学与冷冻电镜结合的高精度复合物结构研究,有助于揭示细菌耐药性机制及用于新型抗生素的研发。
- 孙锐孙玉凡张晓丹陈刚刘梦杰李洁张加吴晶张文宏张颖张文
- 关键词：分枝杆菌结构生物学抗生素耐药性
- 来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质
- 2013年
- 葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal（GenBank AccessionNo．EFS20452．1）构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8．0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45℃。在45℃下孵育2h对ShNAL的活力基本无影响，高于45℃时，活力迅速下降。该酶在pH5．0～10．0的环境中比较稳定，4℃下放置24h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）、N-乙酰甘露糖胺（Man）和丙酮酸（Pyr）的K。值分别是（4．0±0．2）mmol／L、（131．7±12．1）mmol／L和（35．1±3．2）mmol／L，kca／Km值分别为1．9L／（mmol·S）、O．08L／（mmol·S）和0．08L／（mm01·s）。
- 周传华陈曦冯进辉肖冬光吴洽庆朱敦明
- 关键词：葡萄球菌纯化生物催化
- 一种来源于毕赤酵母的高对映选择性羰基还原酶的性质及底物谱分析被引量：2
- 2013年
- 手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇。从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母P.pastorisGS115中的羰基还原酶。根据其核酸序列设计引物,从P.pastoris GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究。PPCR的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.0,低于45℃时有很好的稳定性。对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1。PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97%以上。因此,PPCR具有较好的应用前景。
- 田来强刘卫东陈曦冯进辉杨洪江吴洽庆朱敦明马延和
- 关键词：羰基还原酶手性醇毕赤酵母
- 重组固氮菌腈水合酶催化3-(4-氯苯基)戊二腈的选择性水解
- 2013年
- 通过基因数据挖掘方法(genome mining)获得了来源于固氮菌Herbaspirillum seropedicae SmR1中的腈水合酶基因hsn1。构建了hsn1/pETDuet-1/BL21的大肠杆菌共表达重组菌,经IPTG诱导获得了具有良好催化能力的Co2+依赖型腈水合酶HSN1。利用全细胞反应研究了HSN1的底物谱,发现HSN1对底物3-(4-氯苯基)戊二腈有良好的区域选择性及一定的对映选择性,它可以选择性地水解1个腈基得到3-(4-氯苯基)-4-氰基丁酰胺,该化合物可通过一步化学反应合成巴氯芬。
- 李倩任杰冯进辉吴洽庆朱敦明
- 关键词：腈水合酶
