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荧光假单胞菌高效广谱载体的构建及分析: 2012年; 为促进高GC含量基因在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达效果更加理想、操作更加简便,本研究首先采用不依赖基因序列和连接反应的克隆(Sequence and ligation independent cloning,SLIC)方法将载体pCIBhis上与复制相关的序列和标记基因片段构建成克隆载体pCIBS1.然后优化荧光假单胞菌转化方法,用电转化法将pCIBS1导入荧光假单胞菌BL915中,随后又将T7和tac基因启动子分别插入pCIBS1中,成功构建了表达载体pCIBS3和pCIBS2.研究发现载体pCIBS1在大肠杆菌和荧光假单胞菌中均较为稳定,并且将绿色荧光蛋白基因插入表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,验证了表达载体功能.本研究构建的表达载体和建立的荧光假单胞菌BL915电转化方法,为高GC含量基因在荧光假单胞菌中的表达奠定了基础.; 曹庆华邵欢欢张义正; 关键词：荧光假单胞菌 SLIC GC含量电转化质粒稳定性

运动发酵单胞菌共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶发酵甘薯生产乙醇: 2012年; 运动发酵单胞菌是乙醇发酵的极佳菌种,但其所能利用的发酵底物范围狭窄,不能利用淀粉作为发酵底物.为增加其利用底物的范围使其能够水解淀粉,本研究构建了3种表达淀粉酶的运动发酵单胞菌菌株:1)Zymomonas mobilis(pAmyE)表达α-淀粉酶;2)Z.mobilis(pGA)表达葡萄糖淀粉酶;3)Z.mobilis(pAmyGA)共同表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶.DNS法测定淀粉酶活显示,每种转化菌株的胞外淀粉酶活性均高于胞内,且两种淀粉酶共表达的酶活高于这两种淀粉酶单独表达的酶活之和,说明这两种淀粉酶能够协同作用降解淀粉.对于重组菌株Z.mobilis(pAmyGA),约59.3%的淀粉酶活性都在胞外检测到.用淀粉含量高且耐贮存的徐薯18匀浆加少量葡萄糖作为培养基直接用上述3个菌株发酵生产乙醇.结果显示,共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的重组菌株Z.mobilis(pAmyGA)的乙醇产量为54.7 g/L,达到了理论值的83.2%,表明本研究得到了能够直接高效利用淀粉生产乙醇的运动发酵单胞菌的菌株.; 王广珺何明雄张义正; 关键词：运动发酵单胞菌乙醇发酵甘薯 Α-淀粉酶葡萄糖淀粉酶共表达

大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化被引量：12: 2010年; 为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能,对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化。根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列,利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列,利用SLIC(Sequence and ligation–independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中,成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB。将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达,通过改变培养温度和IPTG浓度等条件,得到了能够大量表达目标蛋白的重组子。结果表明:大肠杆菌BL21(DE3)是gsiB基因表达的最佳宿主菌;18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达;0.1mmol/LIPTG足够诱导gsiB基因表达,增加IPTG浓度(0.1mmol/L～1.0mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达。Western blotting结果显示目标蛋白质有表达,其分子量大小与预期相符。; 王中山向泉桔王海燕张义正; 关键词：大肠杆菌基因表达蛋白质印迹

黄孢原毛平革菌寡肽转运蛋白基因家族的研究: 黄孢原毛平革菌是一种白腐丝状真菌,它在自然界中能将植物产生的木质素彻底矿化为CO和HO,其全基因组的测序工作已经完成。寡肽转运蛋白(Oligopeptide transporter,OPT)广泛存在于细菌,真菌,植物和动...; 王中山向泉桔王广珺王海燕张义正; 文献传递

不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)方法的改进被引量：6: 2010年; SLIC(Sequence and Ligation Independent Cloning)是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法.为了进一步提高该方法的重组效率,将T4连接酶缓冲液改换成退火缓冲液,并使用相应的退火程序,可使重组效率提高至少10倍.此外,参加重组的若干DNA片段在同一反应体系中用T4 DNA聚合酶处理,再使用相同的方法退火,其重组效率仍然可以提高至少10倍.因此,利用本研究所建立的SLIC改进方法,不仅可以提高重组效率,而且还可以用于多DNA片段的高效重组,减少研究者的时间和节约实验成本.; 王广珺何川张义正; 关键词：SLIC DNA重组

大肠杆菌谷胱甘肽转运蛋白的研究: 大肠杆菌中存在一种新发现的谷胱甘肽转运系统,由gsiA,-B,-C,和-D等4个基因编码,隶属于ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白家族,可利用ATP水解所产生的能量移动底物分子跨过细胞膜。其中,g...; 王中山向泉桔王广珺王海燕张义正; 关键词：大肠杆菌基因表达蛋白质相互作用; 文献传递

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国家自然科学基金(30871344)