国家高技术研究发展计划(2001AA21516)
- 作品数：4 被引量：15H指数：3
- 相关作者：邹全明杨珺张卫军蔡绍皙刘开云更多>>
- 相关机构：第三军医大学杭州医学院教育部更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 糖组学研究技术及其进展被引量：8
- 2005年
- 多细胞生物机体内,蛋白质糖基化是一个重要后修饰事件. 蛋白质的糖链不仅仅是区别细胞种类的标志,且与众多的生物现象有关,如细胞发育、分化、形态、肿瘤转移、微生物感染等. 糖组学的内容主要涉及单个个体的全部糖蛋白结构分析,确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的机制. 综述了糖组学的分离和结构鉴定技术及其最新进展.
- 杨珺蔡绍皙邹全明
- 关键词：糖基化作用二维电泳质谱
- N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究被引量：4
- 2009年
- 目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。
- 杨珺张家敏黄卫平张卫军刘开云邹全明
- 关键词：白细胞介素24N-糖基化分泌表达肿瘤细胞凋亡
- 非融合rIL-24蛋白的制备及活性鉴定
- 2009年
- 目的制备非融合的rIL-24蛋白,鉴定其体外诱导肿瘤细胞凋亡活性。方法为制备非融合IL-24蛋白,将IL-24基因插入到pET32a(+)上KpnⅠ与BamHⅠ之间,构建表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coliBL21(DE3)中表达。洗涤后的包涵体溶解在2 mol/L尿素(pH9.0)中,采用镍离子亲和色谱和凝胶分子筛的二步法纯化,肠激酶酶切(肠激酶与蛋白1∶400,pH7.5处理36 h),再用亲和柱色谱纯化制备非融合的rIL-24。MTT法和形态学观察分析rIL-24体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。结果重组工程菌以包涵体形式表达出相对分子质量约为35 000的融合蛋白。包涵体经洗涤、溶解及二步纯化得到纯度大于95%的Trx-IL-24。融合蛋白用肠激酶酶切之后,经亲和色谱制备得到纯度大于98%的非融合蛋白rIL-24。rIL-24显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05),而对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。结论IL-24基因在E.coli中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的非融合蛋白rIL-24,预示其具有肿瘤治疗应用的前景。
- 杨珺张小贤张卫军邹全明
- 关键词：纯化诱导肿瘤细胞凋亡
- 人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化被引量：3
- 2006年
- 目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化。方法分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致。所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%。经纯化后,纯度达85%以上。Westernblot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应。结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础。
- 肖斌杨珺田文标朱永红毛旭虎邹全明
- 关键词：人IL-24克隆离子交换层析
